李剑飞 蔡茂德 钟 亮 曾 湖 韦华军 杨长福

作为来源于上皮的,1种恶性肿瘤，鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是由生活环境和遗传相互影响的典型疾病，包括低分化鳞癌和未分化癌[1-2]，另有临床统计发现[3]，在对世界范围内的鼻咽癌患者进行诊疗时，都能检出EB病毒(Epstein-Barr Virus,EBV)的病毒核抗原和核酸组织，后经多方考证，医学界普遍认为对于EBV的研究将会对鼻咽癌的诊疗和预后提供有价值的新贡献[4]。本文以在我院接受治疗的45例鼻咽癌患者和37例鼻咽炎患者为研究对象，探讨了EBV miRNAs(包括EBV-miR-BART4*和EBV-miR-BART18-3P)在鼻咽癌病灶中的表达情况，现将研究成果报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

本文筛选2014年7月至2016年5月间在我院接受治疗的45例鼻咽癌患者和37例鼻咽炎患者为研究对象，其中鼻咽癌患者中有男性26例，女性19例，年龄33～61岁，平均年龄(46.17±5.39)岁；鼻咽炎患者中有男性15例，女性22例，年龄18～59岁，平均年龄(34.62±3.14)岁。上述所有患者入选前均经过病理学诊断，确诊其症状分别为鼻咽低分化鳞癌和慢性鼻炎粘膜炎，此外所有患者对于本研究的内容和性质均知情且同意，并上报医院伦理委员会批准进行。上述两种患者一般资料的数据间不存在显著性差异(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

本研究的试验方法主要是对从病灶组织中提取得到的miRNA进行PCR实时定量分析，从而了解EBV病毒的miRNA在患者体内的表达情况。

1.2.1 合成PCR引物 首先借助miRNA数据库来查找EBV-miRNA即EBV-miR-BART4*和EBV-miR-BART18-3P的序列情况，采用丹麦Exiqon公司的U6 snRNA (hsa,mmu,rno) PCR primer set,UniRT等来合成PCR引物。

1.2.2 提取病灶组织中的RNA 采用美国Invitrogen公司制造的RNA提取试剂盒进行RNA提取，再用德国Eppendorf公司生产的生物分光光度计检测所提取RNA的浓度和纯度情况，要求其在280 nm波长下吸光度与260 nm波长下的吸光度比值在1.8～2.1之间，最后将其保存于零下80 ℃的冰箱中。

1.2.3 实时荧光定量PCR分析 采用丹麦Exiqon公司生产的cDNA合成试剂盒进行逆转录，按照相应条件进行反应，再采用该公司的SYB®Green master mix和Universal RT试剂盒进行PCR检测，该检测反应在由美国ABI公司生产的7500型号的荧光定量PCR仪器上按照一定的扩增条件进行反应，注意此时反应中引入内参物miR-U6。

1.3 治疗指标

观察EB病毒微小RNA在鼻咽癌和鼻咽炎组织中的表达情况。

1.4 统计学分析

2 结果

鼻咽癌组织中EB病毒两种miRNAs的表达水平明显高于鼻咽炎组织，数据间具有非常显著的差异性(P<0.01)，见表1。

表1 鼻咽癌和鼻咽炎组织中EB病毒miRNAs的表达数值(Ct值)分析

3 讨论

鼻咽癌在我国南方地区、东南亚国家和非洲部分地区为多发病，尤其是在我国南方地区其病死率排在所有恶性肿瘤中的第四位[5]。目前临床上对于此病主要以放射治疗为主，化学治疗为辅[6]，但这对病灶较微小的肿瘤组织和在循环系统中可以转移的肿瘤细胞无法起到良好的杀灭作用，同时又很容易带来诸多不良反应，在对患者的正常免疫功能造成损害的情况下又给患者带来了额外的治疗痛苦。据报道[7]，NPC与众多恶性肿瘤一样在人体内具有逃避免疫的机制，这就无法使免疫系统对其产生特异性的抗肿瘤效应。随着抗肿瘤研究日益进步，目前已有1种新的治疗理念出现，亦即筛选出有效且在肿瘤细胞表面能够进行大量持久表达的抗原靶点，再用其来制备相应的肿瘤疫苗，以便达到机体自身免疫系统可以对其进行特异性免疫清除的治疗目的[8]，本文的研究意义也正是如此。曾有报道认为[9-10]，miRNA和靶基因之间可以进行互相调控来影响表达，而鼻咽癌在早期就可以进行转移，可见miRNA可能正是在早期通过高表达来与靶基因进行互相调控才导致鼻咽癌的发生和转移的。由数据分析可知，EB病毒miRNA确实可以通过高表达来影响鼻咽癌的发生和发展。

综上所述，EB病毒微小RNA可在早期以显著的表达水平导致鼻咽癌的发病和病灶转移，故将其作为防治、诊断鼻咽癌的生物分子标志物是有一定可能性的。

[1] 刘孟忠.鼻咽癌治疗新进展〔J〕.广东医学,2014,35(1):1-4.

[2] 宗井凤.基于调强放疗的鼻咽癌临床分期研究以及EB病毒miRNA-BART7在临床中的应用价值〔D〕.福建医科大学,2014.

[3] 王 艳,王晓枚,成志强,等.鼻咽癌患者外周血及肿瘤原发部位的病毒检测及意义〔J〕.国际肿瘤学杂志,2014,41(5):393-395.

[4] 罗晚媛,唐 莹,何本夫.血浆EBV-DNA表达水平与鼻咽癌分期的相关性分析〔J〕.实用癌症杂志,2015,30(8):1116-1118.

[5] 韦保和,黎柱杨,李海凤,等.1981～2010年鼻咽癌高发地区鼻咽癌患者发病年龄变化分析〔J〕.广西医学,2016,38(6):825-828.

[6] 马 翾,李晓江.复发鼻咽癌的治疗〔J〕.国际肿瘤学杂志,2015,42(2):134-137.

[7] 李舟蕾,任艳鑫,李晓江.鼻咽癌与免疫逃逸〔J〕.国际肿瘤学杂志,2016,43(5):372-375.

[8] 卫 丽,马 萍.肿瘤疫苗临床试验研究现状〔J〕.中华肿瘤防治杂志,2014,21(5):395-400.

[9] 刘 刚,田道法,张 莉,等.鼻咽癌干细胞miRNA表达特征研究〔J〕.中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志,2014,22(5)：38-39.

[10] 李 璐,王建红,黄 辉,等.EB病毒miR-BART4～*和miR-BART18-3p在鼻咽癌中的表达及意义〔J〕.安徽医科大学学报,2015,50(9):1267-1270.