街晓霞 马明悦

抚顺市传染病医院肝病科 （辽宁抚顺，113015）

·实验研究·

缩肝丸对四氯化碳致大鼠肝纤维化的影响

街晓霞 马明悦

抚顺市传染病医院肝病科 （辽宁抚顺，113015）

目的：观察缩肝丸对CCl4致大鼠肝纤维化的防治作用。方法：采用CCl4诱导大鼠肝纤维动物模型。SD雄性大鼠50只，随机分为正常组、CCl4模型组、安络化纤丸组、缩肝丸大剂量组、缩肝丸小剂量组，灌胃给药。用药第10周末处死全部大鼠，留取血清测生化指标，肝组织样本病理切片HE染色及Masson胶原纤维染色镜下观察。结果：缩肝丸可使CCl4造模大鼠血清中ALT、AST、HA、LN、PCⅢ含量降低；HE染色显示缩肝丸可降低炎性细胞浸润程度，减少假小叶的形成和脂质空泡的数量；Masson胶原纤维染色显示缩肝丸可降低胶原纤维增生程度。结论：缩肝丸具有较好的保肝及延缓肝纤维化进程的作用。

缩肝丸；四氯化碳；大鼠；肝纤维化

肝纤维化（LF）是各种慢性肝病发展为肝硬化的中间环节，是可逆的。防止肝纤维化的形成，对预防治疗肝硬化有非常重要的意义。目前治疗肝纤维化尚无特效疗法，有研究表明中药治疗往往效果良好［1］。我国传统中医中药在抗肝纤维化、早期肝硬化方面有长期的临床实践积累［2］，因此中药治疗肝纤维化的作用机制值得研究与挖掘。缩肝丸是我院独有配方制剂，由茵陈、茯苓、柴胡、郁金、当归、红花、苍术、鳖甲组成，具有舒肝理气、活血化瘀、回缩肝脾之功效。本研究主要观察缩肝丸对CCl4大鼠肝纤维化模型的影响，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1．1 主要试剂 CCl4（分析纯），橄榄油（化学纯）。透明质酸（HA），伊莱瑞特生物科技有限公司生产，批号E－EL－0036c；层粘连蛋白（LN），博士德生物工程有限公司生产，批号EK0435；III型前胶原（PCIII），武汉优尔生商贸有限公司生产，批号SED087Ra，均为酶联免疫吸附测定试剂盒。缩肝丸由抚顺市传染病医院制剂室生产，以蒸馏水配成166mg／m l药液；安络化纤丸由森隆药业有限公司出品，以蒸馏水配成110．6mg／ml药液。

1．2 主要仪器 微型高速离心机（C2500-R-230V，美国Labnet）；电热恒温培养箱（ICV-450，日本 ASONE）；全自动酶标仪（Multiskan MK3，Thermo scientific）；全自动生化仪（7020，HITACHI）；病理切片机 RM（2235轮转式切片机，Leica）；显微镜（E100型生物显微镜，NIKON）。

1．3 动物实验 SD雄性大鼠50只，体重150－200g（湖北省实验动物研究中心提供，动物合格证号：42000600008078）。随机分为5组：正常组（即空白对照组）、模型组、安络化纤丸组、缩肝丸大剂量组、缩肝丸小剂量组，每组大鼠数量均为10只。参照文献［3－5］，模型组、安络化纤丸组、缩肝丸大剂量组、缩肝丸小剂量组分别在实验第1日按5ml／kg皮下注射40%CCl4橄榄油溶液，以后按3ml／kg、每周2次皮下注射40%CCl4橄榄油溶液，共10周；正常组皮下注射等体积生理盐水。实验第1天即开始给药。正常组及模型组将生理盐水按5ml／kg灌胃；安络化纤丸组将制备好的安络化纤丸药液按10ml／kg灌胃；缩肝丸小剂量组将制备好的缩肝丸药液按10ml／kg灌胃；缩肝丸大剂量组将制备好的缩肝丸药液按20ml／kg灌胃。每天早晚各1次，持续10周。用药第11周，大鼠腹腔注射100g／L水合氯醛（按3ml／kg剂量）麻醉后，腹主动脉取血，分离血清备检（纤维化、肝功指标检测）。同时取肝左叶于10%福尔马林液固定［3］，常规石蜡包埋，4μm厚连续切片，HE染色及Masson胶原纤维染色。谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）采用全自动生化分析仪进行检测；透明质酸（HA）、层粘蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）按ELLSA试剂盒说明步骤进行。苏木素伊红（HE）染色：光镜下观察肝组织学变化；Masson胶原纤维染色：光镜下观察胶原纤维增生情况。

1．4 数据处理方法 所获数据均采用Microsoft Excel软件进行统计分析，结果以±s表示，多组均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验。P＜0．01表示差异具有统计学意义，P＞0．01表示差异无统计学意义。

2 结果

2．1 各组大鼠血清学检测结果见表1。 缩肝丸大剂量组5项指标均高于正常组，但低于模型组，差异具有统计学意义；缩肝丸小剂量组5项指标均高于正常组，但低于模型组，与模型组比较HA、LN、PCⅢ差异具有统计学意义。缩肝丸大、小剂量组虽未能完全防止肝纤维化的形成，但具有减轻其肝纤维化程度的作用。

表1 各组大鼠血清学检测结果比较 （±s）

表1 各组大鼠血清学检测结果比较 （±s）

与正常组比较 ＃P＜0．01；与模型组比较，*P＜0．01

组别 ALT（U／L）AST（U／L）HA（ng／mL）LN（ng／mL）PCⅢ（ng／m L）正常组（n＝10）45±3．85 75±10．51 110．23±16．13 125．60±8．44 42．23±3．13模型组（n＝10）239±22．29＃252±23．87＃232．60±25．87＃181．47±10．19＃169．77±4．65＃安络化纤丸组（n＝10）130±12．53*160±11．26*142．18±13．40*142．68±4．88*98．51±3．99*缩肝丸大剂量组（n＝10）178±12．29*190±6．17*150．42±11．33*150．19±5．76*116．33±3．29*缩肝丸小剂量组（n＝10）210±5．40 221±10．91 177．14±14．74*161．19±5．72*128．52±3．49*

2．2 HE染色结果 正常组肝小叶结构完整，无肝细胞脂肪变性、坏死，无纤维组织增生，肝细胞索围绕中央静脉呈放射状整齐排列，未见明显病变；模型组见正常肝小叶结构被破坏，肝细胞索排列紊乱，大量假小叶形成，假小叶周围由增生的纤维组织包绕，假小叶内无中央静脉，肝细胞肿大，大量炎性细胞浸润，少量脂肪变性；缩肝丸小剂量组，肝小叶结构基本清晰，少量炎性细胞浸润及少许纤维组织增生，脂肪变性明显；缩肝丸大剂量组、安络化纤丸组肝小叶结构基本清晰，少量炎性细胞浸润及少许纤维组织增生，相比模型组肝组织病理改变明显改善（见插页图1）。

2．3 Masson胶原纤维染色结果 正常组仅在中央静脉周围出现极少量的蓝色胶原纤维；模型组胶原纤维增生明显，大量存在于汇管区，少量存在于中央静脉周围，肝实质内可见增生的胶原纤维形成纤维间隔分割包绕肝细胞形成假小叶；缩肝丸大剂量组、安络化纤丸组的胶原纤维增生量均少于模型组，胶原纤维增生受到明显抑制，汇管区及肝小叶中央静脉胶原纤维明显减少，肝实质内增生的胶原纤维较短较细，肝小叶结构破坏减轻，虽未能完全防止胶原纤维的增生，但能降低胶原纤维增生的程度；缩肝丸小剂量组防止胶原纤维增生效果不如上述两组，但仍然较模型组有所改善，胶原纤维组织增生有所减少（见插页图2）。

3 讨论

本研究表明：缩肝丸可使CCl4造模大鼠血清中ALT、AST、HA、LN、PCⅢ含量降低，保持肝小叶结构正常，抑制胶原纤维增生，使肝细胞索疏松而窄，且多集中在中央静脉周围，肝细胞水肿、脂肪变性、炎细胞浸润减少，提示缩肝丸具有较好的保肝及延缓肝纤维化形成的作用。

肝纤维化在中医学属“黄疸”、“胁痛”、“肝瘟”、“积聚”等范畴。基本病机是正衰邪盛、热毒瘀结、肝脾损伤。肝为藏血之脏，肝郁气滞，导致血瘀。缩肝丸配方中由具有活血化淤功效的红花、当归，佐以郁金、柴胡舒肝理气，茵陈清热利湿，外加鳖甲软坚散结，茯苓、苍术健脾。整个配方起到了舒肝理气、活血化瘀、回缩肝脾的作用。现代研究表明，肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）激活造成细胞外间质成分（ECM）生成过多，降解相对不足，在肝内过度沉积是肝纤维化形成的重要原因。有研究表明红花能够通过下调肝组织中TIMP－1的表达而相对降低TIMP-1／MMP-1来促进ECM降解发挥抗肝纤维化作用［6］，鳖甲经煎煮亦可发挥抑制HSC增殖的作用［7］。但缩肝丸配方组成药味众多，哪一味中药在起关键作用尚不明确，其作用机理有待进一步研究。

［1］王英凯，王丹，唐彤宇．鳖甲为主的中药治疗肝纤维化的实验室和临床研究［J］．临床肝胆病杂志，2002，18（4）：253．

［2］赵景民，周光德，李文淑，等．复方鳖甲软肝片抗肝纤维化机制的实验研究［J］．解放军医学杂志，2004，29（7）：560．

［5］陈奇．中药药理研究方法学（第2版）［M］．北京：人民卫生出版社，2006：727．

［6］李仪奎．中药药理实验方法学（第2版）［M］．上海：上海科学技术出版社，2006：527．

［7］金俊杰，钟鸣，余胜民，黄洁玲．四氯化碳致肝纤维化大鼠模型药理实验方法学研究［J］．时珍国医国药，2012，23（7）：1659－1660．

［8］王雅，熊焰，张涛，孙克伟．鳖龙软肝片抗肝纤维化临床观察［J］．湖南中医药大学学报，2010，30（9）：181－182．

［9］杨洁，蔡刁龙，谭献文，等．柴胡、红花、川芎中药单体对大鼠肝纤维化治疗作用的实验研究．临床和实验医学杂志．2009，8（7）：1－3．

［10］高建蓉，张赤志，邵志华，等．鳖甲对肝星状细胞增殖影响的研究．实用医学杂志．2007，23（11）：1618－1620．

10．3969／j．issn．1005-0264．2017．05．011

2017－03－27 编辑：陈盛铎）