王鸣 韩文正 关韶峰 翟馨蓉 方唯一 曲新凯

基础研究

不同剂量苯酚去肾交感神经术对自发性高血压大鼠血压的影响

王鸣 韩文正 关韶峰 翟馨蓉 方唯一 曲新凯

目的 探讨不同剂量苯酚去肾交感神经术对自发性高血压大鼠血压影响。方法 选用12周龄自发性高血压大鼠，肾动静脉局部涂抹不同剂量的苯酚，按照给药剂量分为4组：假手术组、0.5 ml苯酚组、1.0 ml苯酚组和1.5 ml苯酚组。大鼠适应性饲养1周，监测血压，1周后行苯酚化学腐蚀神经术，术后4周处死大鼠，采血，肾动脉及肾神经组织送检。采用ELISA法测定血浆去甲肾上腺素含量，肾动脉采用HE、Masson、PAS染色，肾神经采用免疫组化酪氨酸羟化酶染色及神经丝蛋白染色。结果 与假手术组相比，术后4 周，1.0 ml苯酚组血压显著降低［（163.60±5.87）mm Hg 比（193.70±6.07）mm Hg，P＜0.01］，血浆去甲肾上腺素含量显著降低［（50.50±31.01）ng/L 比（197.50±35.27）ng/L，P＜0.01］；HE 染色，肾动脉轻度损伤，神经中度损伤（3.46±0.30 比 0.44±0.30，P＜0.01），酪氨酸羟化酶低表达（0.51±0.30 比 2.58±0.30，P＜0.01），神经丝蛋白高表达（2.27±0.30 比 0.09±0.10，P＜0.01）。结论 1.0 ml苯酚化学腐蚀神经术能够有效损伤肾神经，显著降低血压，且不造成肾动脉狭窄，其机制可能与肾交感神经酪氨酸羟化酶活性低有关。

去肾交感神经；高血压；苯酚；酪氨酸羟化酶

交感神经亢进是高血压发生的重要机制之一。20世纪50年代，有研究者采用手术完全切断交感神经的非药物方式来治疗高血压，发现能显著降低血压，但却带来严重的并发症[1]。2009年Krum等[2]发现，经皮肾动脉消融术射频消融能有效控制难治性高血压。随后HTN-2（Simplicity Hypertension 2）的成功进一步地证实了去肾交感神经术的安全性和有效性[3]。但 HTN-3（Simplicity Hypertension 3）的失败对肾动脉射频消融技术的可行性提出了质疑[4]，其中一个主要问题是神经的消融程度不明确[5]，尤其在大鼠去肾交感神经模型上，既往研究采用经典苯酚化学腐蚀肾交感神经，但消融细节不明确，没有一个消融标准，消融程度时间也不同[6-8]，因而结果也不尽相同。本课题利用苯酚化学腐蚀神经法来建立自发性高血压大鼠去肾交感神经模型，探讨合理苯酚消融时间、浓度和剂量。

1 材料与方法

1.1 主要材料 雄性自发性高血压大鼠（spontaneous hypertensive rats，SHR），12 周龄，40 只，由上海斯莱克有限公司提供，分笼饲养于标准环境下，1周后开始实验。所有实验操作流程均符合上海交通大学医学院实验动物保护和使用守则。去甲肾上腺素（NE）ELISA试剂盒购买于上海钰博生物科技有限公司；神经丝蛋白（NF200）抗体（abcam官网，编号 ab82259），酪氨酸羟化酶（TH）抗体（abcam 官网，编号 ab112）。

1.2 方法

1.2.1 分组 将SHR大鼠随机分为4组：①假手术组，生理盐水擦拭肾动脉（n=10）；②手术组（共3组），分别用苯酚擦拭肾动脉 1 min（0.5 ml）、2 min（1.0 ml）、3 min（1.5 ml），每组各 10 只。术前及术后每周无创尾动脉测血压；4周后处死大鼠，留取血浆测去甲肾上腺素含量，肾动脉、肾神经组织送检。

1.2.2 去肾交感神经方法 腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉大鼠，备皮，消毒铺巾，腹白线正中切开，逐层分离皮下组织及肌肉，暴露肾门，游离肾动脉，在显微镜下（×25）剥离肾动脉表面所有结缔组织，同时用棉签蘸溶于95%乙醇的10%苯酚溶液，涂抹双侧肾动静脉表面，分别用0.5 ml涂抹1 min，1.0 ml涂抹 2 min，1.5 ml涂抹 3 min。假手术仅暴露肾门，不剥离动静脉鞘，仅用生理盐水涂抹。逐层缝合伤口，术后给予青霉素80万U 3 d，预防感染。

1.2.3 血压测量 应用大鼠无创尾动脉测压计（BP-2000 SERIESⅡ）测量血压。室温（22±2）℃，将大鼠放置固定装置中，测量仪的尾部气囊套入鼠尾，待大鼠安静后，缓慢加热至39℃使鼠尾血管扩张，同时将四通道采集仪连接电脑，待电脑采集信号稳定后，充气加压，直至脉搏信号成一条直线，然后逐渐放弃减压，待出现规则波形信号时，电脑显示数值。每只大鼠重复3次，间隔30 min，测平均值。

1.2.4 血浆去甲肾上腺素测定及肾动脉、肾交感神经病理检验 4周后处死大鼠，心脏采血，血液标本均以3000 r/min离心15 min，分离出血浆，采用ELISA法测定血浆去甲肾上腺素（去甲肾上腺素试剂盒购于上海钰博生物科技有限公司），严格按照试剂盒说明书进行操作。取左侧肾动脉，行石蜡固定包埋切片HE染色，同时肾交感神经染色采用免疫组织化学方法检测TH和NF200表达情况。每张切片随机取10个视野进行拍照。

光镜下评估神经损伤，采取半定量评分法。0分：无损伤，正常形态。1分：极轻度损伤，神经束外膜少量炎症反应，纤维化，神经束少许空泡化。2分：轻度损伤，神经束外膜部分炎症反应，纤维化，神经束部分空泡化，伴核固缩，轴索损害，出现极少量髓鞘消解腔。3分：中度损伤，神经束外膜中度炎症反应，纤维化，神经束重度空泡化，部分核固缩，出现髓鞘消解腔，肿胀。4分：重度损伤，神经束外膜严重炎症反应，纤维化，神经束正常结构消失、坏死、纤维化。

免疫组化NF200和TH染色同样采用半定量积分法。0分：对TH或NF200完全无反应，无染色。1分：对TH或NF200微弱反应，染色弱阳性。2分：对TH或NF200有反应，染色阳性。3分：对TH或NF200强烈反应，染色强阳性。

肾动脉损伤半定量评分法。0分：正常形态。1分：极轻度损伤，内膜丢失小于血管周径25%，中膜损伤范围小于血管周径25%，损伤深度小于中膜25%。2分：轻度损伤，内膜丢失介于血管周径25%～50%，中膜损伤范围介于血管周径25%～50%，损伤深度介于中膜25%～50%。3分：中度损伤，内膜丢失介于血管周径50%～75%，中膜损伤范围介于血管周径50%～75%，损伤深度介于中膜50%～75%。4分：重度损伤，内膜丢失大于血管周径75%，中膜损伤范围大于血管周径75%，损伤深度大于中膜75%；或者中膜变薄小于中膜50%[9]。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行分析。实验结果用±s表示，组间比较采用one-way ANOVA，组间多重比较采用LSD-t检验，多组等级资料比较采用非参数检验Kruskal-Wallis H法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠存活情况 1.5 ml苯酚组术后第7天、第9天各死亡1只大鼠，均死于肠梗阻，腹腔感染；假手术组及 0.5 ml、1.0 ml苯酚组无死亡。

2.2 各组大鼠收缩压的变化 术前，SHR大鼠基线血压各组间未见统计学差异。去肾交感神经术后1周，手术组大鼠血压较假手术组明显降低（P＜0.01）。术后 2～4 周，1.5 ml组大鼠收缩压较假手术组逐渐增高（P＜0.01），而 1.0 ml组大鼠与假手术组相比，收缩压显著降低（P＜0.01），0.5 ml组大鼠与假手术组相比未见统计学差异（P＞0.05）。见表1。

2.3 血浆去甲肾上腺素变化 术后4周，假手术组、0.5 ml组、1.5 ml组大鼠血浆去甲肾上腺素含量比较未见统计学差异（P＞0.05），而 1.0 ml组大鼠血浆去甲肾上腺素较假手术组明显降低（P＜0.01）。见表1。

表1 RDN术后各组大鼠血压和血清指标变化（±s）

表1 RDN术后各组大鼠血压和血清指标变化（±s）

注：与假手术组相比，aP＜0.01，bP＜0.05

收缩压（mm Hg）组别 例数术前 术后1周 术后2周 术后3周 术后4周假手术组 10 175.90±5.89 177.50±5.28 184.30±4.74 190.50±4.28 193.70±6.07 197.50±35.27 0.5 ml苯酚组 10 178.30±5.69 169.40±7.71a 181.00±4.37 187.10±4.23 192.20±3.94 218.40±33.71 1.0 ml苯酚组 10 179.10±5.51 167.60±4.35a 172.10±5.13a 165.90±4.56a 163.60±5.87a 50.50±31.01a 1.5 ml苯酚组 10 175.30±4.83 169.00±6.88a 189.70±5.11a 195.70±3.71a 200.00±7.11b 174.90±33.32去甲肾上腺素（ng/L）术后4周

2.4 肾动脉组织学变化 对左侧肾动脉进行HE、Masson、PAS 染色后发现，1.5 ml组大鼠血管内皮细胞脱落，内膜明显增厚并向管腔突出，平滑肌细胞增生，细胞排列紊乱，中膜平滑肌增生，血壁破坏，炎症细胞浸润；而假手术组、0.5 ml组、1.0 ml组大鼠肾动脉内膜未见明显增生，血管内皮及内膜下弹力纤维完整。肾动脉损伤评分：1.5 ml苯酚组中重度损伤，其余各组正常至轻度损伤。见图1，表2。

2.5 肾交感神经形态学变化 HE染色下，假手术组为正常肾动脉外周交感神经；0.5 ml苯酚组肾交感神经轻度炎症细胞浸润，神经束外膜破裂不完整；1.0 ml组和 1.5 ml组中度炎性细胞浸润及纤维化，核空泡化，核萎缩，部分神经细胞正常结构消失。

免疫组化检测：假手术组及0.5 ml组NF200表达低，而 1.0 ml组和 1.5 ml组表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。假手术组及 0.5 ml组TH 高表达，而 1.0 ml组和 1.5 ml组低表达，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图2，表2。

表2 RDN术后各组大鼠肾动脉和肾交感神经损伤评分（±s）

表2 RDN术后各组大鼠肾动脉和肾交感神经损伤评分（±s）

注：与假手术组相比，aP＜0.01

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3 讨论

肾脏神经支配丰富，主要分为传入神经和传出神经。传入神经大部分起源于肾盂管壁，感受机械和化学刺激，接受T6～L4脊髓的交感神经节后纤维支配，并将感受信息传入中枢下丘脑和延髓头端腹外侧区[10]，继而通过传出神经刺激β1肾上腺素受体增加肾素的分泌；刺激α1肾上腺素受体增加肾小管的水钠重吸收；刺激α1受体降低肾血流的灌注，从而影响血压[11]。然而由于缺乏评价肾交感神经消融程度的即刻指标，无论是临床试验还是动物模型，术后结果不尽相同[5,7,12]。本实验采用苯酚消融方法，通过肾交感神经病理染色结合血浆去甲肾上腺素，从形态学和功能上探讨大鼠肾交感神经消融模型苯酚的使用量。结果发现，使用1.0 ml苯酚溶液棉签擦拭肾交感神经能够有效腐蚀神经，降低血压，而不损伤肾动脉，有助于提高建模成功率及有效率。

既往有研究者在动物模型中采用电刺激肾交感神经，通过即刻观察肾血流量变化来证明手术有效性，发现采用 15 V，0.2 ms和 10 Hz，30 s两种刺激方法肾血流量未见明显改变[12]；也有研究采用肾脏组织中去甲肾上腺素含量低于对照组10%来作为去神经成功的标准[7]。TH是机体儿茶酚胺的限速酶，反映局部组织交感活性。Burgi等[13]的研究发现，TH可作为交感神经活性的标志，反映交感神经活性与血压之间的关系，去神经后TH表达下降。NF是神经元特有的结构蛋白，主要分布在神经元的胞体及突起内，NF200作为其中一种亚型，在正常情况下只存在于轴索中，胞体很少含有，正常神经NF200染色为阴性，神经损伤后NF200可出现阳性表达。因此本实验采用肾交感神经HE染色及TH、NF200免疫组织化学染色同时结合血浆肾素含量来作为去神经成功的标准。

苯酚是一种强烈的化学腐蚀剂，可引起蛋白质发生凝固性坏死。本实验利用苯酚对神经的化学毁损，以达到去神经目的。实验中发现：①与假手术组相比，1.0 ml和 1.5 ml苯酚组神经毁损明显，0.5 ml苯酚组神经仅有轻度损伤，术后4周未见神经再生；②术后1周与对照组相比，手术组血压均有不同程度降低，可能是去神经后动脉管壁牵张程度降低，压力感受器受抑制，从而中枢交感系统抑制解除[14]，也可能与围术期进食量少有关；③术后4个月与假手术组相比，只有1.0 ml苯酚组血压下降，0.5 ml苯酚组血压无下降趋势，而 1.5 ml苯酚组血压明显升高，血浆去甲肾上腺素与血压变化趋势一致。通过进一步肾动脉病理检测发现，1.5 ml苯酚组大鼠肾动脉狭窄明显，其余各组无肾动脉狭窄。1.5 ml苯酚组术后有2只大鼠死于肠梗阻，考虑苯酚使用过量、接触时间较长，导致神经过度消融，进而腐蚀肾动脉造成肾动脉狭窄，引起肾性高血压，同时过量的苯酚也破坏肾动脉周围组织，如回肠及直肠黏膜，引起机械性肠梗阻。另外0.5 ml苯酚组大鼠神经轻度损伤，血压无下降趋势，表明0.5 ml苯酚量不足以对肾神经有效腐蚀。

综上所述，本研究通过苯酚腐蚀神经法建立去肾交感神经模型，观察不同剂量苯酚溶液对神经腐蚀的程度，血压的变化，发现采用1.0 ml苯酚溶液棉签擦拭肾交感神经2 min可以有效腐蚀神经达到去肾交感神经目的，并不造成肾动脉狭窄，术后4周内血压逐渐下降，且未见神经再生，血浆去甲肾上腺素含量降低，病理证实酪氨酸羟化酶表达降低，因此血压下降可能与去神经后交感神经活性降低有关。在后续研究中，我们将对RDN治疗的自发性高血压大鼠进行分子生物学检查，深入探讨RDN降低大鼠血压的作用机制。

（本文图片见后插二）

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Effect of renal sympathetic denervation with different dose phenol on blood pressure in spontaneous hypertension rats

WANG Ming，HAN Wen-zheng，GUAN Shao-feng，et al.Department of Cardiology，Shanghai Chest Hospital，Shanghai 200030，China

QU Xin-kai，E-mail：qxkchest@126.com

ObjectiveTo investigate the impact of renal sympathetic denervation（RDN）with a suitable dosage of phenol on the blood pressure，plasma noradrenaline and renal nerves injury in spontaneous hypertension rats（SHRs）.MethodsMale SHRs were randomly divided into four groups：the 0.5 ml phenol group which was subjected to RDN at the age of 13 weeks；the 1.0 ml phenol group；1.5 ml phenol group and the Sham group which underwent the sham procedure（n=10，each group）.Blood pressure was measured every week using the tailcuff plethysmography.Four weeks after the RDN or sham operation，plasma norepinephrine（NE）were assessed.Kidney artery and nerve tissue were collected and characterized by immunohistochemically analyses.ResultsCompared with Sham group，the 1.0 ml phenol group with RDN significantly attenuated the progressive increase in blood pressure ［（163.60±5.87）mm Hg vs（193.70±6.07）mm Hg，P ＜0.01］and decreased plasma NE level［（50.50±31.01）ng/L vs（197.50±35.27）ng/L，P＜0.01］.The result of HE staining showed mild injury of renal artery in 1.0 ml phenol group and moderate to severe injury in 1.5 ml phenol group，while severe injury of renal nerves were occurred in 1ml phenol group and 1.5 ml phenol group.RDN treatment also inhibited the expression of tyrosine hydroxylase（TH）and increased the expression of neurofilament protein（NF200）in renal nerves in 1ml phenol group compared with sham group［TH score：0.51±0.30 vs 2.58±0.30，P＜0.01；NF200 score：2.27±0.30 vs 0.09±0.10，P＜0.01］.ConclusionRDN with 1.0 ml phenol can effectively destroy the renal nerves without renal arterial stenosis and decrease blood pressure in SHRs，which might be associated with inhibition of expression of TH.

Renal sympathetic denervation；Hypertension；Phenol；Tyrosine hydroxylase

国家自然科学基金项目（项目编号：81370361）；上海市科委（项目编号：12140902800）；上海市申康医院发展中心（项目编号：SHDC12012101）；上海市胸科医院科技发展基金项目（项目编号：2014YZDH20300）

200030 上海市，上海交通大学附属胸科医院心内科

曲新凯，E-mail：qxkchest@126.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2017.11.020

Q95-33；R544.1

A

1672-5301（2017）11-1036-04

2017-07-18)