黄晓霞 梁奇伟冯惠岗 庄炜钊 林桂仪 王浩 邢会杰 陈汉威 黄益李龙

下肢静脉曲张是一种常见的周围血管性疾病，表现为下肢浅静脉的迂曲、延长和扩张，具有很高的患病率和致残率[1]。泡沫硬化疗法因其创伤小、操作方便、安全性好多用于治疗下肢静脉曲张，其原理主要是硬化剂引起血管内皮及中膜损伤，致使内皮下胶原蛋白暴露，从而促进中外膜胶原蛋白纤维化，引起血管闭塞[2]。有研究发现下肢静脉曲张泡沫硬化术后1～3年随访过程中，再通率和再发反流率在20%～32%[3]，有研究提出这与硬化治疗后血管残留的上皮细胞有关[4-5]。不同的泡沫硬化剂有不同的硬化效力，国内临床上使用较多的治疗下肢静脉曲张的泡沫硬化剂主要有鱼肝油酸钠和聚多卡醇注射液[6]，但其作用机制尚未明确，本研究采用动物实验探讨其作用机制。

材料与方法

一、材料

12只健康比格犬购自华南农业大学动物实验中心，雌雄不限，体质量6～7 kg。造影剂：碘普罗胺注射液，麻醉剂：1%聚多卡醇注射液（2 ml/支，德国Chemische Fabrik Kreussler&Co.GmbH 生产），5%鱼肝油酸钠注射液（2 ml/支，上海东海制药厂生产）。基于Tessari法将聚多卡醇或鱼肝油酸钠注射液与空气按1∶4比例制成泡沫硬化剂。主要设备：数字减影血管造影（DSA）购自美国GE公司，型号：INNOVA3100；光镜购自北京拓普康医疗器械公司、Aperio数字病理分析扫描仪购自上海基因科技股份有限公司。

二、实验动物分组

每只比格犬右前肢静脉注射生理盐水，为对照组（n=12）。将12只比格犬随机分为两个实验组，每组6只。于每只犬的3条静脉（左前肢、左后肢、右后肢）注射硬化剂，聚多卡醇组注入1%聚多卡醇泡沫硬化剂，鱼肝油酸钠组注射5%鱼肝油酸钠泡沫硬化剂，每组各注射18条静脉。

三、实验方法

对比格犬备皮、麻醉消毒后，戴颈脖套。在膝关节上水平隐静脉作标记，局部穿刺大隐静脉，回抽见静脉血后固定留置针。将犬侧卧于DSA治疗床上，X线透视下注入适量碘普罗胺对比剂行隐静脉全程造影，记录静脉血流方向的对比剂用量。于右前肢注入等量生理盐水，余肢体静脉注入即时配制的相应组别的泡沫硬化剂，注意控制推注速度，用量为置换隐静脉内对比剂充盈的血容量，拔除留置针止血，用弹力绷带适当加压包扎四肢，送回动物实验中心饲养。待犬隐静脉注完泡沫硬化剂后30 min、2 d、28 d分别采集其大隐静脉。硬化治疗后局部麻醉消毒手术切开皮肤，取膝上大隐静脉约5 cm，放入液氮气内储存，送回实验中心后用10%福尔马林固定，制作切片，HE染色和Masson染色后于光镜下观察，并采用数字病理分析扫描仪采用以下3个指标来评估内皮和中膜的损伤。①内皮脱失率：血管腔中缺失内皮细胞的周长与整个管腔的周长的比值，缺失的内皮细胞周围可出现黄褐色物质（图1、2）。②中膜损伤深度：管腔内层至最开始出现病理平滑肌细胞（病理平滑肌细胞具有肿胀性、苍白性、核分裂异常特点）的距离（图3）。③中膜损伤率：中膜损伤深度与中膜厚度的比值（图3、4）。

四、统计学处理

结 果

一、光镜观察结果

两个实验组注射泡沫硬化剂后30 min，大部分血管内皮细胞局部坏死脱落，中膜和外膜无明显变化。注射后2 d，血管内皮细胞坏死脱落，中膜平滑肌细胞排列紊乱，外膜无明显变化（图5）。注射后28 d，血管壁增厚，管腔缩小；Masson染色见血管壁平滑肌细胞增生，管腔闭塞（图6）。而对照组血管壁及血管管腔未见异常变化。

二、两组注射硬化剂后不同时点的内皮脱失率和中膜损伤率比较

注射硬化剂后30 min，聚多卡醇组和鱼肝油酸钠组的内皮脱失率分别达95.32%和93.95%，表明这两种硬化剂均对血管内皮产生明显破坏作用。而对照组内皮基本无损伤，其内皮脱失率和中膜损伤率基本为0，故下面只比较聚多卡醇组和鱼肝油酸钠组血管损伤的差异。

注射硬化剂后30 min，聚多卡醇组与鱼肝油酸钠组的内皮脱失率和中膜损伤率差异无统计学意义；注射后2 d，聚多卡醇组的中膜损伤率高于鱼肝油酸钠组，差异有统计学意义（P＜0.05）。鱼肝油酸钠组注射后2 d的内皮脱失率高于注射后30 min，差异有统计学意义（t=18.003，P=0.011），见表 1。

表1 两组注射硬化剂后不同时点的内皮脱失率和中膜损伤率比较 （n=18，%，±s）

表1 两组注射硬化剂后不同时点的内皮脱失率和中膜损伤率比较 （n=18，%，±s）

组别 内皮脱失率 中膜损伤率聚多卡醇组鱼肝油酸钠组t值P值30 min 95.3±0.6 93.9±0.3 0.971 0.352 2 d 99.3±0.6 99.6±0.3-0.221 0.681 30 min 19.3±2.0 22.0±6.4-1.881 0.712 2 d 63.6±9.4 49.2±4.4 2.314 0.030

三、两组注射硬化剂后的中膜厚度比较

两组注射后28 d的中膜厚度均大于注射后2 d的厚度，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组注射硬化剂后的中膜厚度比较（n=18，μm，±s）

表2 两组注射硬化剂后的中膜厚度比较（n=18，μm，±s）

组别聚多卡醇组鱼肝油酸钠组2 d 150.40±33.12 182.29±10.34 28 d 510.82±20.12 408.28±20.12 t值3.291 6.880 P值0.013 0.008

讨 论

图1 注射聚多卡醇30 min，蓝色曲线为剩余的内皮细胞的管腔周长；图2 注射聚多卡醇30 min后，蓝色线为管腔周长；图3 注射聚多卡醇30min后，红色直线为中膜损伤的深度；图4 注射聚多卡醇30min后，红色直线为中膜损伤的深度，蓝色直线为中膜的厚度

图5 鱼肝油酸钠组注射配制的鱼肝油酸钠硬化剂后2 d，可见血管内皮细胞大部分脱落，平滑肌细胞排列紊乱（HE，×40）；图6 聚多卡醇组注射配制的聚多卡醇硬化剂后28 d，可见血管壁增厚，管腔缩小闭塞（HE，×40）

下肢静脉曲张是一种常见的血管外科疾病，可导致下肢静脉性溃疡等不良并发症，重者会导致残疾。该病的病因多为深静脉及交通支瓣膜功能不全，传统的治疗方法为大隐静脉高位结扎术及曲张静脉剥脱术，但创伤较大，近年来泡沫硬化治疗应用越来越多，但长期随访发现硬化治疗的复发率较高[7]。本研究采用DSA引导下注入泡沫硬化剂，可避免超声引导空间分辨率不够的缺点，且透视下操作保证了血管内壁全部暴露，结果发现两种硬化剂均未见血管残腔，可认为DSA透视下静脉硬化注药疗效更优。

国内多采用鱼肝油酸钠和聚多卡醇这两种泡沫硬化剂。泡沫硬化剂的作用机制为：血管的内皮细胞膜上聚集足够的有机分子后发生乳化作用，可使细胞膜的一处或多处发生变性并溶解，变性的细胞呈现气球样变，可出现脱落[8]。本研究结果示，聚多卡醇组和鱼肝油酸钠组注射后15 min及2 d的内皮脱失率均高于生理盐水对照组，同一个时间点两种硬化剂的内皮脱失率未见明显差异，表明两种硬化剂对血管内皮层的破坏程度无明显差异。鱼肝油酸钠组在注射后2 d的内皮脱失率较15 min大，提示鱼肝油酸钠在2 d内都处于硬化破坏内皮的过程中，而聚多卡醇注射后15 min的内皮脱失率达95.3%，与注射后2 d的内皮脱失率（99.3%）无明显差别，提示鱼肝油酸钠破坏内皮细胞的速度较聚多卡醇慢。

硬化剂产生连锁反应的机制为：内皮细胞的脱失可充分暴露内膜下组织，血管发生痉挛，中膜继续受到破坏，继而可诱发血小板聚集激发凝血机制并刺激细胞基质纤维化[8]。本研究中注射聚多卡醇和鱼肝油酸钠后15 min的中膜损伤率差异无统计学意义，注射后2 d，聚多卡醇的中膜损伤率高于鱼肝油酸钠，表明硬化治疗后短期（2 d）内，聚多卡醇的硬化效力强于鱼肝油酸钠。

廖恺等[9]对兔的耳缘静脉进行硬化处理，发现血管腔内纤维条索在硬化治疗后30 d出现，照此本研究选了术后28 d为时点进行研究，发现术后28 d两组的中膜厚度均大于2 d，表明硬化处理后2～28 d，中膜仍处于纤维化过程。且聚多卡醇组28 d的中膜厚度比鱼肝油酸钠组厚，提示聚多卡醇的血管纤维化作用较鱼肝油酸钠强。

综上，聚多卡醇和鱼肝油酸钠在硬化治疗短期（2 d）内的内皮损伤程度未见明显差异，但前者对中膜的损伤程度强于后者；治疗后中期（28 d）聚多卡醇的血管纤维化作用较鱼肝油酸钠强，可能与其对中膜损伤的程度有关。聚多卡醇是一种更为理想的下肢静脉泡沫硬化剂，值得进一步推广。