彭健，张耀婷，李慧，肖小龙，韦超盈，周宇筝，卢爱，张礼铭，周梅，陈杰，丁成明，夏赞贤

（1.中南大学湘雅医院，湖南 长沙 410008；2.中南大学生命科学学院，湖南 长沙 410013）

啤酒酵母Ubr1野生型和缺失型菌株的比较蛋白组学分析*

彭健1，张耀婷1，李慧2，肖小龙2，韦超盈2，周宇筝2，卢爱2，张礼铭2，周梅2，陈杰1，丁成明1，夏赞贤2

（1.中南大学湘雅医院，湖南 长沙 410008；2.中南大学生命科学学院，湖南 长沙 410013）

目的寻找并验证Ubr1泛素化底物蛋白大规模筛选方法的可行性。方法通过对啤酒酵母RJD347（Ubr1野生型）和AVY26（Ubr1缺失型）的差异蛋白质组学比较，分析酵母中可能存在的Ubr1直接或间接作用的底物蛋白。进一步通过外源表达实验验证差异蛋白与Ubr1之间的相关性。结果组学研究得到249个差异表达蛋白，其中145个蛋白在AVY26（Ubr1缺失型）中表达上调。选取其中40个并外源表达验证5个差异蛋白MLC2、SCD6、ARG1、HOG1及RTF1与Ubr1具有相关性，受泛素连接酶Ubr1的泛素化调控。结论建立Ubr1泛素化底物候选蛋白库，同时验证出5个潜在Ubr1泛素化底物蛋白。

啤酒酵母；泛素连接酶E3成分N-识别蛋白1；泛素化；蛋白质组学

Abstract:ObjectiveTo justify the rationality of proteomic screening on a large scale and identify potential substrates ofUbr1with the approach.MethodsIn this work,comparative proteomic analysis between RJD347(Ubr1wild type)and AVY26(Ubr1deletion type)has been performed to screen the possible substrate proteins ofUbr1.Moreover,the correlation between the differentially expressed proteins andUbr1was further verified by protein work.ResultsIn total,249 proteins which were differentially expressed were identified,of which 145 proteins were up-regulated in AVY26.Furthermore,the protein work confirmed 5 proteins including MLC2,SCD6,ARG1,HOG1 and RTF1 that were closely related toUbr1.ConclusionsA massive database of 249 proteins that are differentially expressed between RJD347 and AVY26 is established.Five potential substrates ofUbr1ubiquitination proteins is identified,which provides the experimental basis for further understanding of biological processes ofUbr1.

Keywords:Saccharomyces cerevisiae;ubiquitin protein ligase E3 component N-recognin 1;ubiquitination;proteomics

泛素（ubiquitin）是一种包含76个氨基酸并存在 于所有真核生物中的小分子蛋白[1]。泛素化修饰参与细胞周期调控、细胞增殖和凋亡、脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）损伤、基因表达、信号传递及炎症反应等几乎一切生命活动[2-3]，并且与肿瘤[4]、心血管等[5]疾病的发生密切相关。在泛素化修饰过程中，泛素连接酶对底物的识别是决定泛素化修饰特异性的关键[6]。泛素连接酶E3成分N-识别蛋白1（ubiquitin protein ligase E3 component N-recognin 1，Ubr1）已被证明是N端规则信号通路最重要的E3连接酶，能识别含不稳定氨基酸末端的蛋白质[7]，结构上存在3个底物结合位点，分别能特异性结合蛋白质的碱性N端残基，大的疏水性N端残基，以及分子内包含Ubr1结合结构域的转录抑制因子CUP9[8]。在啤酒酵母中，Ubr1通过泛素化降解转录抑制因子CUP9，从而调控寡肽/二肽转移蛋白2（peptide transporter 2,PTR2）的表达，促进酵母对寡肽和二肽的吸收[8]。Ubr1在人体组织和细胞中也有表达，且与人肿瘤蛋白p53诱导蛋白3（TP53I3）的泛素化降解有关[9]。此外，有研究表明，Ubr1作为N端规则信号通路上的泛素连接酶，能够识别细胞质内错误折叠的蛋白并使之通过泛素-蛋白酶体途径降解[10]。然而，目前研究确定的Ubr1泛素化底物数量有限，绝大多数Ubr1的底物尚未被发现，缺乏系统性的底物筛选研究。

鉴定E3连接酶的底物不仅可以使笔者了解E3连接酶参与到的生物学过程，而且有助于笔者深入研究该E3连接酶催化底物泛素化的分子机制。传统的研究E3连接酶底物的方法通常是利用酵母双杂交等技术筛选相互作用的蛋白质[11]，再通过体外泛素化反应和体内泛素化反应的方法确定与该E3连接酶相互作用的蛋白质是否是其底物。但该技术通量低，效率不高[12]。因此，筛选鉴定泛素化底物是当前泛素化研究的主要难点。蛋白质组学是后基因组时代主要的研究方法之一，能够在蛋白质水平上直接、大规模研究基因功能。YUMIMOTO等[13]采用差异蛋白质组质谱鉴定方法对F-box族的泛素连接酶进行底物筛选，鉴定到515个与3个E3连接酶相互作用的蛋白。因此，差异蛋白质组质谱鉴定法是分析泛素连接酶底物的有力工具[13]。

酵母作为模式生物，不仅具有原核生物操作简单、生长快速的特点，并且还具有真核细胞翻译后修饰功能的优势[14]。因此，本实验通过对Ubr1野生型RJD347及Ubr1缺失型AVY26的比较蛋白质组学研究，分析啤酒酵母中可能存在的Ubr1直接或间接作用的底物蛋白。

1 材料与方法

1.1 菌株及主要试剂

1.1.1 菌株Escherichia coliDH5α（由本实验室提供），酵母菌株（MATaura 3-52）[8]、AVY26（MATaura 3-52Ubr1Δ，Hi3G）[8]、Ubr1 野生型（Saccharomyces cerevisiae SC295）、（MATα GAL4 GAL80 ura 3-52、Leu 2-3、112 reg1-501 gal1 pep 4-3）[7]及 Ubr1 缺失型[Saccharomyce scerevisiae SC295（Ubr1Δ）]（SC295 ubr deleted）[7]（由本实验室构建保存[7]）（见表1）。

1.1.2 主要材料和试剂表达载体pFLAGUBR1-SBX（由本实验室构建并保存），鼠抗Flag单克隆抗体（美国Sigma公司）、辣根过氧化物酶HRP-兔抗鼠抗体（上海Beyotime Biotechnology公司）、内切酶XhoⅠ和SalⅠ及T4连接酶（美国New England Biolabs公司），其他化学试剂如组氨酸、尿嘧啶、聚乙二醇PEG3350、醋酸锂及单链鲑鱼精子等均为国产分析纯。实验所用菌株及载体信息见表1。

表1 引物设计

1.2 菌体蛋白样品的准备

挑取RJD347和AVY26分别接种至酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（YPD培养基）中，30℃培养至菌体OD600约为0.75，离心收集菌体，用酵母裂解缓冲液（SDT缓冲液）重悬菌体，经Fast Prep-24高速均质器（美国MP Biomedicals公司）裂解60s，13000 r/min离心，上清液经蛋白样品酶解（filter-aidedsample preparation，FASP）用于质谱分析。

1.3 质谱分析

Q Exactive HF质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）与液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）系统联用，对肽段样品进行检测。

1.4 质粒构建及酵母转化

1.4.1 质粒构建以提取的酵母基因组DNA为模板，聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增 5 个差异蛋白（MLC2、SCD6、ARG1、HOG1 和RTF1）基因，PCR所用引物设计见表1。XhoⅠ和SalⅠ双酶切扩增片段及pFLAG-UBR1-SBX载体片段，胶回收酶切产物，酶连过夜后转化至Escherichia coli DH5α，涂布于含氨苄的LB培养板，37℃过夜培养，筛选阳性单克隆菌落，提取质粒，双酶切鉴定后取阳性克隆质粒送铂尚生物公司测序。

1.4.2 酵母转化取对数生长期的SC295和SC295（Ubr1Δ）菌液离心，去上清液，磷酸盐缓冲液PBS冲洗2次，实验组取1 μg质粒（加无菌水至34 μl）、对照组（无菌水 34 μl）分别加入适量 PEG3301、醋酸锂、鲑鱼单链精子后转化至SC295和SC295（Ubr1Δ）的沉淀中，42℃温浴40min，加入1ml YPD，30℃摇床培养2～3 h，涂布于SD-L培养板，30℃培养2～3d，挑取单克隆菌液进行PCR验证。

1.5 Western blot检测

挑取阳性单克隆菌落，经10%的聚丙烯酰胺凝胶分离后，电转移至聚偏氟乙烯PVDF膜上，以5%脱脂牛奶室温摇床封闭1h，加入鼠抗Flag单克隆抗体，室温摇床孵育2h，加入HRP标记的兔抗鼠IgG，室温摇床孵育1 h，ECL发光成像。

1.6 统计学方法

采用DAVID在线对酵母细胞胞内差异蛋白进行功能注释聚类分析；应用R语言“heatmap”包绘制蛋白差异表达聚类图。

2 结果

2.1 RJD347与AVY26胞内蛋白组学差异分析

RJD347、AVY26胞内总蛋白质谱分析共检测到2 388种蛋白，其中有249种蛋白在RJD347（Ubr1野生型）和AVY26（Ubr1缺失型）中不同（见图1），该蛋白中，145个蛋白在AVY26中表达上调。由于Ubr1已被证明是N端规则信号通路最重要的E3连接酶，因此在AVY26中，Ubr1泛素化底物的含量上升。由此可见，质谱结果检测到的145个上调蛋白可能是UBR1潜在的泛素化底物。

此外，结果发现AVY26中有104个蛋白表达呈下调趋势（见图1），质谱结果也显示，PTR2蛋白在AVY26中含量较野生型减少（见表2）。笔者筛选RJD347与AVY26蛋白表达差异倍数较大的40种蛋白进行进一步分析（见表2），表3分别列出AVY26/RJD347（A/R）胞内蛋白差异倍数Ratio等相关信息。其中Ratio（A/R）＞1表示该蛋白在突变菌株中升高，Ratio（A/R）＜1为蛋白在突变菌株中降低。表3中列举在AVY26胞内蛋白含量上升的20种蛋白，该上调的蛋白可能是E3连接酶Ubr1潜在的泛素化底物。进一步通过数据库查找及文献比对，发现差异倍数较大的蛋白如 MLC2、SCD6及ARG家族（ARG1、3、4、5、6 和 7）、HOG1、GDH1、RTF1、AKR1、HXT4 及 SMC3目前还未有研究报道与Ubr1泛素化调节相关。见表2和图2。

图1 RJD347与AVY26胞内蛋白表达差异聚类图

2.2 外源验证差异蛋白与Ubr1的相关性

SC295菌株因缺失pep4-3基因编码翻译后调控酵母液泡水解酶，这有利于蛋白外源表达及稳定性的检测。为进一步验证上述差异蛋白与Ubr1之间的相关性，笔者筛选差异最大的5种差异蛋白进行外源验证，在总蛋白趋于一致的情况下（见图2），MLC2、SCD6、ARG1、HOG1 在 SC295 中未检测到蛋白表达，而在SC295（Ubr1Δ）中检测到蛋白高表达（见图2A～D）。RTF1虽然在SC295能够被检测，但在SC295（Ubr1Δ）中蛋白水平明显高于野生菌（见图2E）。由此看出，在SC295中，Ubr1的潜在作用底物 MLC2、SCD6、ARG1、HOG1 及 RTF1 由于受Ubr1的调控，可能被泛素化降解，因而无法检测到蛋白的表达或检测到低表达；而在SC295（Ubr1Δ）中，则呈现相反的结果（见图3）。因此，可以初步确定MLC2、SCD6、ARG1、HOG1 及 RTF1 蛋白与泛素连接酶Ubr1相关，并可能是泛素化Ubr1的直接作用底物。该实验结果也与质谱组学分析相符。

表2 RJD347与AVY26中差异最大的前40种胞内蛋白

图2 Ubr1泛素化底物筛选差异倍数

图3 差异蛋白转化至野生型和突变型Ubr1中的蛋白表达

3 讨论

目前研究发现，Ubr1在酵母系统中存在221个相互作用蛋白，而在人体中则证实只存在84个相互作用蛋白。本研究通过比对RJD347与AVY26胞内蛋白质组的差异，发现共249个蛋白有差异表达，其中145个蛋白在AVY26中含量增加，104个蛋白含量降低。由于Ubr1作为泛素E3连接酶，可直接调控底物蛋白的泛素化降解，因此145个在AVY26中含量增加的蛋白为泛素连接酶Ubr1的潜在泛素化底物。进一步通过外源验证蛋白MLC2、SCD6、ARG1、HOG1及RTF1在SC295（Ubr1Δ）中表达提高。

泛素连接酶Ubr1的潜在泛素化底物在酵母生理代谢过程中起重要的作用，SCD6是翻译起始抑制子，在DNA复制应激时形成胞间集合体，通过其RGG结构域结合eIF4G抑制前起始复合物的募集[15]。值得注意的是，一些Ubr1潜在的泛素化底物蛋白在人体中也存在其相应的同源蛋白，且与人体多种疾病相关并参与有机体重要的活动调控。酵母源MLC2（myolp Light Chain）可调控酵母细胞Ⅱ型肌球蛋白Myolp轻链，参与Myolp重链轻链环肽解体[16]，对应人源肌球蛋白调节轻链激酶MLC2（Myosin light chain 2）在人体中具有催化肌球蛋白的磷酸化，控制平滑肌的收缩活动的作用，MLC2的表达失调可导致原发性心肌症的发生[17]。此外，精氨酸酶（Arginase）家族中的 ARG1、3、4、5、6 及 7 检测到在 Ubr1Δ 缺失型中高表达（见表3），说明ARG家族蛋白为Ubr1的潜在直接底物。酵母Ubr1泛素化底物的筛选研究有助于笔者深入了解Ubr1参与生物学过程，同时还可以为人体内Ubr1介导的N端规则及对应的泛素化底物筛选提供线索，为研究上述相关疾病发病机制及人类生命活动提供新思路。

本研究采用差异蛋白质组学的方法筛选Ubr1泛素化底物的方法，不仅不受蛋白表达纯化的影响，覆盖率广，可直接检测细胞内生理状态下的Ubr1作用底物，提高实验的准确性，为筛选鉴定E3连接酶Ubr1作用底物提供大量候选蛋白，为研究Ubr1催化底物泛素化的机制提供实验依据，对研究该潜在底物的同源蛋白是否受泛素化调节生命活动及相关疾病具有重要意义。

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Comparative proteomic analysis ofUbr1wild type and deletion type ofSaccharomyces cerevisiae*

Jian Peng1,Yao-ting Zhang1,Hui Li2,Xiao-long Xiao2,Chao-ying Wei2,Yu-zheng Zhou2,Ai Lu2,Li-ming Zhang2,Mei Zhou2,Jie Chen1,Cheng-ming Ding1,Zan-xian Xia2
(1.Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan 410008,China;2.School of Life Sciences,Central South University,Changsha,Hunan 410013,China)

Q591.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.21.004

1005-8982（2017）21-0018-07

2017-04-11

国家自然科学基金联合项目（No：U1603126）；湖南省自然科学基金（No：2017JJ2334）

夏赞贤，E-mail：xiazanxian@sklmg.edu.cn