梁志白，赵枫

（中国人民解放军第180医院 骨二科，福建 泉州 362000）

脂联素抑制人髓核细胞分泌疼痛介质PGE2的初步机制研究

梁志白，赵枫

（中国人民解放军第180医院 骨二科，福建 泉州 362000）

目的验证脂联素在椎间盘源性腰痛患者中可能发挥的抗炎作用，并初步研究其机制。方法首先检测髓核组织内脂联素受体表达水平；随后提取并培养人髓核细胞，检测炎症因子TNF-α对髓核细胞内脂联素受体调控；最后采用慢病毒基因沉默的手段检测脂联素抑制炎症因子诱导髓核细胞产生PGE-2的作用及机制。结果椎间盘源性腰痛患者髓核组织内脂联素受体Adipo R1/2表达水平低于正常髓核组织（P＜0.05），炎症介质TNF-α能抑制脂联素受体AdipoR1/2的表达（P＜0.05）。当脂联素处理髓核细胞后，TNF-α对PGE-2分泌的诱导受抑并且呈浓度剂量依赖效应（P＜0.05）；髓核细胞过表达Adipo R1/R2后，均能抑制炎症因子TNF-α诱导髓核细胞产生PGE-2，其中以Adipo R2为明显（P＜0.05）。结论脂联素能够通过两个受体Adipo R1、Adipo R2抑制抑制髓核细胞合成分泌疼痛介质PGE-2，提示脂联素可能为一个保护性因子在椎间盘源性腰痛环境中发挥抗炎作用。

椎间盘源性腰痛；脂联素；炎症反应；PGE-2

Abstract:ObjectiveTo investigate the anti-inflammatory effects of adiponectin in patients with discogenic back pain and the potential mechanism.MethodsThe expression of adiponectin receptor Adipo R1/2 in human nucleus pulposus (NP)tissue was examined.Human NP cells were isolated for further culture.The regulatory effect of TNF-α on adiponectin receptors in NP cells was detected.Moreover,lentiviral gene silencing technology was utilized to investigate the inhibitory effect of adiponectin on TNF-α-induced production of PGE-2 and underlying mechanism.ResultsThe expression of Adipo R1/2 was significantly decreased in NP tissues derived from patients with discogenic back pain compared with normal NP tissues(P＜0.05).TNF-α inhibited the expression of Adipo R1/2,and up-regulated the secretion of PGE2 in NP cells,which was attenuated by adiponectin dose-dependently (P＜0.05).Over-expression of Adipo R1/2 abolished the TNF-α-induced PGE2 production (P＜0.05).ConclusionsAdiponectin is potentially a protective mediator in patients with discogenic back pain through AdipoR1/2-dependent inhibition of secretion of PGE2.

Keywords: discogenic back pain;adiponectin;inflammation;PGE2

椎间盘源性疼痛是指椎间盘退变、椎间盘内部结构与功能紊乱刺激神经末梢疼痛感受器引发的疼痛，同时排除神经机械压迫引发的腰腿痛[1]。后续研究证实盘源性疼痛与椎间盘内疼痛介质密切相关，如一氧化二氮（nitrous oxide，N2O）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、环加氧酶（cyclooxygenase 2，Cox2）或磷脂酶 A2（phospholipase A2，PLA2）[2]，能刺激长入的末梢神经和背根神经节诱发椎间盘源性腰痛。

脂联素（adiponectin，Apn）是由脂肪细胞分泌的一种激素蛋白，多项研究证实Apn具有抗炎、抗氧化应激等功用[3]。Apn可以促进巨噬细胞、单核细胞及树突状细胞分泌促炎因子拮抗剂，对抗炎症刺激、延缓炎症反应进程[4]。椎间盘源性腰痛患者髓核组织存在广泛炎症级联反应内环境，Apn能否调节椎间盘内炎症恶性循环尚未清楚。本实验拟通过体外培养人髓核细胞，检测Apn在人髓核细胞中的抗炎作用及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 髓核组织获取及细胞培养

正常椎间盘组织取自因腰椎爆裂性骨折行椎间盘摘除骨折复位内固定者，盘源性腰痛椎间盘组织取自于因盘源性腰痛行椎间盘摘除者，置入-80℃冷冻保存备用。人髓核细胞购自无锡英纽瑞生物医药科技有限公司（货号INV-HN0094），培养方法依照RISBUD等[5]文献报道。细胞传代至3～5代用于后续试验。

1.2 试剂耗材

人全长 Apn（Catalog no.1065-AP；R&D 公司），MEM 培养基（Gibco公司），Adipo R1、Adipo R2抗体（ab189446 44 kDa，ab126611 43 kDa，Abacm 公司），β-Tubulin Antibody抗体（#2146，CST公司），前列腺素E2（PGE2）ELISA试剂盒（Catalog no.ADI-900-001；Enzo Life公司），慢病毒 LV-sh Adipo R1和LV-sh Adipo R2（购自百恩维生物）。

1.3 细胞处理

培养人髓核细胞，使用肿瘤坏死因子α（TNF-α）（0、12.5 及 25μg/ml）处理髓核细胞，实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测 Adipo R1、Adipo R2的表达情况以明确炎症因子对脂联素受体的调控。随后采用 TNF-α（25 μg/ml）处理髓核细胞，于 0、12及 24 h收集细胞，qRT-PCR检测 Adipo R1、Adipo R2的表达以确定炎症因子对脂联素受体调控的时间曲线。

离体培养人髓核细胞，首先使用不同浓度Apn联合 TNF-α 处理细胞，分为 4组：Ctr、TNF-α（25 μg/ml）、TNF-α（25 μg/ml）+Apn（1 μg/ml）和TNF-α（25 μg/ml）+Apn（5 μg/ml），24 h 后收细胞上清液，酶联免疫吸附测定（ELISA）检测PGE-2浓度。

为进一步明确脂联素受体在Apn抑制髓核细胞产生PGE-2、PLA2中的作用，构建慢病毒Adipo R1、Adipo R2过表达载体Lenti-Adipo R1/R2。采用qRT-PCR方法检测髓核细胞中Adipo R1、Adipo R2的过表达情况以确保Adipo R1、Adipo R2表达率升高2倍以上；检测人髓核细胞中Adipo R1、Adipo R2过表达后，TNF-α对PGE-2的诱导情况：病毒转染人髓核细胞5 d后加入TNF-α诱导，24 h后收集细胞上清液，ELISA检测PGE-2浓度。

1.4 Western blot检测

微量二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA)法检测蛋白浓度。取20 μg蛋白样本、配置10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，PVDF膜将分离后蛋白转印纸膜上，3%BSA室温封闭1 h，PGE-2（1∶2 000）一抗4℃摇床孵育过夜，室温二抗孵育1 h，ECL发光液孵育并曝光。

附表 qRT-PCR引物序列

1.5 qRT-PCR

依据说明书将2 μg总RNA逆转录为cDNA，采用SYSB Green（TaKaRa公司）试剂进行扩增，ABI 7500检测，内参采用β-actin。每样本设立3副孔、每组实验重复3次。使用Primer Premier 5.0设计引物，引物序列见附表。

1.6 ELISA

依据说明书将人髓核细胞以1×105个/孔接种于24孔板，分别给予不同分组刺激后，移除上清液并无菌磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗，37℃孵育30 min后收集上清，严格按照ELISA说明书检测上清液中PGE2的含量，所测浓度以ng/ml表示。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 16.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 盘源性疼痛患者血清中脂联素受体水平

髓核组织内存在脂联素受体Adipo R1/R2 mRNA，盘源性腰痛患者髓核组织内脂联素受体Adipo R1/2表达水平降低，以Adipo R2降低明显。Western blot显示类似结果。见图1。

图1 髓核组织内脂联素受体表达水平

2.2 炎症因子对髓核细胞内脂联素受体的调控作用

人髓核细胞经不同浓度TNF-α处理后，脂联素受体Adipo R1/R2 mRNA表达降低，并于25 μg/ml时达到低谷；时间曲线显示25μg/ml TNF-α能抑制人髓核细胞内Adipo R1/R2 mRNA表达，并与24 h达到最低值。Western blot结果显示脂联素能抑制人髓核细胞内Adipo R1/R2蛋白表达，并于24 h达到低谷。见图2。

图2 炎症因子对髓核细胞内脂联素受体调控

2.3 Apn对髓核细胞内炎症因子诱导PGE2分泌的影响

人髓核细胞经TNF-α处理后，PGE2含量升高，当加入Apn后，TNF-α对PGE2分泌的诱导则受抑制并且呈浓度依赖效应（P＜0.05）。见图3。

图3 Apn对髓核细胞内炎症因子诱导PGE-2分泌的影响

2.4 Apn对髓核细胞内脂联素受体表达的影响

Apn能促进髓核组织内存在脂联素受体Adipo R1/R2 mRNA表达。见图4。

图4 Apn对髓核细胞Adipo R1/R2 mRNA表达的影响

2.5 髓核细胞内Adipo R1/R2表达情况及对炎症因子PGE-2分泌的影响

髓核细胞感染Lenti-Adipo R1/R2过表达病毒后，髓核细胞内Adipo R1/R2表达升高，均超过2倍以上。见图5A～E。

应用慢病毒技术过表达髓核细胞内Adipo R1/R2后，再给予TNF-α刺激髓核细胞，均能抑制炎症因子TNF-α诱导髓核细胞产生PGE2，其中以Adipo R2明显。见图5F。

图5 Apn抑制炎症因子诱导髓核细胞产生PGE2

3 讨论

CROCK等[1]率先提出椎间盘结构与功能紊乱刺激椎间盘疼痛感受器为椎间盘源性腰痛的发病机制。随着椎间盘退变进展，纤维环由内至外逐渐撕裂、微小血管和末梢神经沿破裂纤维环长入椎间盘，同时髓核内产生的炎症因子渗漏至相邻硬膜外结构、硬脊膜、脊神经节的背根神经，炎症因子刺激长入末梢神经和背根神经节诱发椎间盘源性腰痛。目前研究证实，IL-1β、TNF-α 及磷脂酶 A2（PLA2）是与神经根性病变相关的重要促炎因子[7]，其能刺激细胞产生疼痛介质PGE2诱发疼痛，抑制IL-1β、TNF-α和PLA2的活性可以降低硬膜外炎症反应、缓解疼痛[8]。

脂联素（Adiponectin，Apn）是由脂肪细胞分泌的一种激素蛋白，多项研究证实，Apn具有抗炎、抗氧化应激等功用[3，9]。既往研究显示，Apn在骨关节炎中既存在促炎和抗炎双重作用。Apn诱导COX-2和膜结合型前列腺素E合成酶-1的表达，导致PGE2合成分泌增加、刺激疼痛[10]。然而亦有实验发现，Apn能缓解DBA/1小鼠的胶原诱导性关节炎模型中骨关节炎严重程度，同时可以减少关节中IL-1β、TNF-α和MMP-3的表达[11]。髓核细胞属于软骨样细胞，与关节软骨细胞具有相似的细胞行为学。

本研究着重于检测Apn在椎间盘源性腰痛患者中可能发挥的抗炎作用，结果显示盘源性腰痛患者髓核组织内脂联素受体Adipo R1/2表达水平降低；为进一步研究是否椎间盘源性腰痛患者椎间盘内炎性环境诱导的Adipo R1/2表达差异，本研究采用炎症因子TNF-α处理髓核细胞，结果显示炎症介质TNF-α能抑制Apn受体Adipo R1/2的表达，鉴于TNF-α亦是椎间盘退变的细胞模型诱导剂，本结果与既往研究类似[12]。TERASHIMA等[12]发现，随着椎间盘退变进展AdipoR1/2表达呈下降趋势，此外Apn能抑制IL-1β对髓核/纤维环细胞合成分泌炎症因子TNF-α的诱导作用。结果表明Apn参与椎间盘内炎症抑制作用。

鉴于椎间盘源性腰痛患者髓核细胞分泌大量疼痛介质如PGE2等，为检测Apn是否能抑制髓核细胞合成分泌疼痛介质，采用Apn处理髓核细胞，结果显示Apn能抑制TNF-α诱导髓核细胞分泌PGE2、并且呈浓度剂量依赖效应。进一步构建慢病毒Adipo R1、Adipo R2过表达载体；发现髓核细胞过表达Adipo R1/R2后，均能抑制TNF-α对髓核细胞产生PGE2的诱导作用。结果表明，Adipo R1、Adipo R2均参与抑制髓核细胞合成分泌疼痛介质PGE2，Apn在椎间盘源性腰痛环境中发挥抗炎、抗应激的功能。

综上所述，本研究通过慢病毒基因沉默等试验发现Apn能够通过2个受体Adipo R1及Adipo R2抑制抑制髓核细胞合成分泌疼痛介质PGE-2，提示Apn可能作为一个保护性因子在椎间盘源性腰痛环境中发挥抗炎、抗应激。因此，可考虑Apn治疗椎间盘源性腰痛，接下来可以进一步体内实验验证上述作用及相关机制。

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Inhibitory effect of adiponectin on secretion of PGE2 in human nucleus pulposus cells

Zhi-bai Liang,Feng Zhao
(Department of Orthopeadic Surgery,the 180th Hospital of PLA,Quanzhou,Fujian 362000,China)

R274.34

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.21.007

1005-8982（2017）21-0037-06

2017-03-13