孟庆滔 王斯 刘凯 何霁云 何森 张昕 王勇 石如峰 施迪 文博 潘佩 周雨霏朱小江 廖行 张鑫 张强 蔡亚丽 刘琦 严心 李欣然 龚深圳 阳钰婕 陈晓平

药物与临床

上皮细胞钠通道α亚单位（α-ENaC）基因单核苷酸多态性与四川藏族高血压氢氯噻嗪疗效的关联分析

孟庆滔 王斯 刘凯 何霁云 何森 张昕 王勇 石如峰 施迪 文博 潘佩 周雨霏朱小江 廖行 张鑫 张强 蔡亚丽 刘琦 严心 李欣然 龚深圳 阳钰婕 陈晓平

基金来源：四川省科技厅-支撑计划项目（项目编号：2012SZ0131）

目的 研究四川省甘孜州藏族僧尼群体轻度高血压患者对小剂量氢氯噻嗪治疗的反应和耐受性，并比较α-ENaC基因四个单核苷酸多态性位点（SNP）不同基因型/等位基因携带者降压反应的差异。方法 对符合纳入标准的120例初发藏族轻度高血压患者进行问卷调查、体格检查、血清学检测；提取其外周血白细胞DNA进行PCR扩增，使用分子质谱法对α-ENaC基因四个SNP位点rs2228576、rs10849447、rs13306613和rs3782727进行分型；并对所有入选患者进行为期1个月的小剂量氢氯噻嗪（12.5 mg qd）干预。结果 该研究群体用药前的平均收缩压为153.73 mm Hg，用药后的平均收缩压为143.52 mm Hg，较用药前血压值下降10.21 mm Hg；用药前的平均舒张压为90.94 mm Hg，用药后的平均舒张压为85.16 mm Hg，较用药前血压值下降5.78 mm Hg。药物达标总人数为40人，达标率为36.70%。协方差分析未发现上述四个位点不同基因型携带者的血压下降值具有显著差异。多元线性回归也未发现上述SNP位点的突变与血压下降值有显著关联。结论 小剂量氢氯噻嗪可以在短期内显著降低藏族轻度高血压患者的血压水平，但未发现以上SNP位点对降压程度有显著影响。

αENaC； 单核苷酸多态性； 僧尼； 藏族； 原发性高血压； 氢氯噻嗪

藏族高血压患病率居全国各民族首位，治疗率和控制率低[1]。因藏族高血压的盐敏感特质，降压药物氢氯噻嗪可能对其疗效较好[2,3]，但缺乏证据。上皮细胞钠通道α亚单位（α-ENaC）[4,5]基因 SNP位点 rs2228576[6-9]、rs10849447[10]、rs13306613[11,12]和rs3782727[13]与高血压相关，其可能通过调节水钠潴留影响氢氯噻嗪的疗效[14]。本研究拟对藏族高血压患者进行氢氯噻嗪短期干预，并分析上述SNP位点对降压的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选自四川省甘孜州色达县（海拔3700米）五明佛学院的藏族僧尼，其祖籍分布四川、青海、西藏各地，彼此无亲缘关系。所有研究对象均签署知情同意书。研究方案通过四川大学华西医院伦理委员会审查通过。

纳入标准：①从未服用降压药物的1级高血压患者；②藏族，世居高原；③年龄18～80岁；④有独立的行为能力；⑤愿意参加该试验。

排除标准：①继发性高血压；②已知的慢性肾病、肝功能不全；③慢性心功能不全；④肥厚梗阻性心肌病、主动脉瓣狭窄；⑤试验前6个月内有不稳定型心绞痛、急性心肌梗死、经皮冠状动脉成形术、冠状动脉旁路术后、高血压脑病、脑血管意外、短暂性脑缺血发作、确诊的视网膜出血或渗出等；⑥现存的严重影响药物吸收、分布、代谢及排泄的其他疾病。

1.2 基线资料搜集

1.2.1 基本资料搜集 研究对象大多不懂汉语，故问卷调查通过当地少数民族医疗人员翻译进行，内容包括年龄、性别、既往病史、饮食、运动、吸烟、饮酒史等基本信息，并调查其饮用清茶、奶茶、酥油茶时是否加盐。体格检查包括测量身高、体重、腰围、臀围、血压、心率等。研究对象均在空腹8～12 h后采集血液5 ml，当场离心（3000 r/min，10 min）分装，干冰运输至四川大学华西医院生化实验室行全血细胞及生化检测。

1.2.2 DNA提取和鉴定 从康为世纪购买基因组DNA试剂盒和RNA酶，按步骤提取外周血白细胞DNA。随机抽检样本OD260/OD280在1.7～2.1。调整DNA终浓度为10～30 ng/ml，-20℃储存备用。

1.2.3 质谱法测定SNP序列 采用质谱法对SNP位点 rs2228576、rs13306613、rs10849447、rs3782727进行分型检测。该检测由上海英潍捷基生命技术公司（Invitrogen）辅助完成。

通过PCR扩增目标DNA模板，引物序列见表1。循环步骤为，Step 1：95 ℃，2 min；Step 2：95 ℃，30 s；Step 3：56 ℃，30 s；Step 4：72 ℃，60 s；Step 5：72 ℃，5 min；Step 6：25℃，∞。其中 Step 2到 Step 4重复循环45次。

表1 PCR引物序列和扩增参数

扩增产物纯化后，对待检位点进行单碱基延伸。设计位点特异性延伸引物（序列见表2）。在PCR仪中按照下述程序进行延伸反应。Step 1：94℃，30 s；Step 2：94 ℃，5 s；Step 3：52 ℃，5 s；Step 4：80 ℃，5 s；Step 5：72 ℃，3 min。其中Step 2到 Step 4重复40个循环。最终在突变位点处延伸一个碱基并终止，此碱基即突变位点，延伸引物将根据突变类型的差异而连接上不同的ddNTPs，形成分子量差异。延伸产物纯化后点样至靶片上，使用质谱仪对其分子质量进行检测，从而得到各SNP位点的具体基因型。

1.3 药物治疗

1.3.1 试验药物及用药方案 氢氯噻嗪（片剂，25mg/片，山西云鹏制药有限公司生产，批号：A140704）12.5 mg，每日1次，治疗4周。为预防低血钾，同时每日口服氯化钾缓释片0.5 g，并鼓励患者多吃蔬菜、水果，告知患者若感不适及时与当地研究小组联系。

表2 延伸引物序列和参数

1.3.2 随访观察 治疗4周末进行访视。内容包括：测量血压，取3次测量读数的平均值；登记药物干预期间出现的不良反应；完善心电图检查。

以SBP、DBP对比基线血压的下降幅度作为疗效评估值；收缩压（SBP）＜140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），舒张压（DBP）＜90 mm Hg为降压达标。如血压达标，继续使用氢氯噻嗪降压治疗；如血压未达标则可加用血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）、血管紧张素受体阻滞剂（ARB）或钙通道阻滞剂（CCB）中的一种。一旦出现严重电解质紊乱、代谢紊乱、过敏等不良反应，根据情况决定是否停药。

服药依从性采用药物覆盖率（proportion of days covered，PDC） 评价，PDC=（发放双克片数－剩余片数）*2/总用药天数。PDC≥80%认为依从性良好。

1.4 统计学方法 统计分析均使用SPSS 19.0软件包。符合正态分布的计量资料以±s表示，否则以中位数（四分位间距）表示。计数资料以百分率描述。计量资料采用t检验或单因素方差分析（ANOVA）两组间比较，并采用LSD进行多组间两两比较。计数资料采用卡方检验分析。Haploview软件检测Hardy-Weinberg平衡（H-W平衡）。采用协方差分析比较不同基因型/等位基因携带者的血压下降值。多元线型回归模型分析基因型降压幅度的关联。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基线资料 入选研究对象共120例。其中4例生化指标不完整，4例基因提取失败，3例基因型测定失败，资料完整的受试对象共109例，平均年龄为57.39岁，男性患者占45.9%。无患者因不良反应中途停药，亦无严重不良事件发生。平均依从性约88%。

如表3所示，受试对象各平均指标无明显异常，男性与女性受试者相比，年龄较轻，血红蛋白水平较高，血钾水平较低。

2.2 降压疗效 总人群在用药前的平均收缩压为（153.73±12.21）mm Hg，用药后的平均收缩压为（143.52±9.92）mm Hg，较用药前血压值显著下降（10.21±3.90）mm Hg（P＜0.01）。总人群在用药前的平均舒张压为（90.94±9.18）mm Hg，用药后的平均舒张压为（85.16±7.65）mm Hg，较用药前血压值显著下降（5.78±2.85）mm Hg（P＜0.01）。经过 1 个月治疗后，药物达标总人数为40人，达标率为36.70%。

通过协方差分析校正了年龄、BMI、服药前血压、血糖、肌酐、血钠、血钾、喝茶加盐和佛教相关活动后，男性和女性的收缩压[（10.14±3.68）mm Hg比（10.17±4.14）mm Hg，P=0.45]、舒张压[（5.56±2.77）mm Hg 比（5.97±2.93）mm Hg，P=0.346]下降值未见统计学差异。

表3 研究对象的基本资料（±s）

表3 研究对象的基本资料（±s）

注：SBP：收缩压；DBP：舒张压；BMI：体重指数；TC：总胆固醇；TG：甘油三酯；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇

组别 例数 年龄（岁） 用药前SBP（mm Hg） 用药后SBP（mm Hg） △SBP（mm Hg） 用药前DBP（mm Hg） 用药后DBP（mm Hg）男性 50 53.26±16.95 153.99±11.43 143.85±9.37 10.14±3.68 89.81±8.62 84.25±6.97女性 59 60.90±12.66 153.51±12.92 143.24±10.43 10.17±4.14 91.89±9.60 85.92±8.15 P值 ＜0.01 0.838 0.749 0.969 0.240 0.257组别△DBP（mm Hg）BMI（kg/m2）Glu（mmol/L）TC（mmol/L）TG（mmol/L）LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）男性 5.56±2.77 27.65±4.07 5.04±1.12 4.82±1.20 1.64±0.84 2.86±0.89 1.08±0.23女性 5.97±2.93 26.27±4.71 5.31±0.73 5.12±1.34 1.57±1.02 3.00±1.15 1.46±0.70 P值 0.459 0.125 0.248 0.265 0.720 0.521 ＜0.01组别Cr（μmol/L）尿酸（μmol/L）血红蛋白（g/L）血钠（mmol/L）血钾（mmol/L）血钠/血钾男性 83.06±23.26 389.09±101.99 188.93±24.56 142.72±5.00 4.26±0.39 33.76±3.19女性 72.55±18.52 332.56±75.33 166.42±24.76 142.67±2.45 4.79±0.79 30.39±4.36 P值 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.01 0.947 ＜0.01 ＜0.01

2.3 研究人群的Hardy-Weinberg平衡检验 从表4可见，四个位点都符合Hardy-Weinberg平衡，证明双克治疗的研究人群具有较好的群体代表性，数据来自同一孟德尔群体。

2.4 α-ENaC基因单个位点与降压效果的关联分析 表5代表了α-ENaC四个位点的不同基因型模型和等位基因模型与降压效果之间的关联情况。若突变纯合子基因型数量≤3个，则因数量太少而没有进行累加模型和隐性模型的比较，只是与杂合子进行合并后进行了显性模型的分析。

表4 藏族α-ENaC基因4个位点基因型分布的Hardy-Weinberg平衡检验

结果显示，无论是男性患者还是女性患者，无论是收缩压还是舒张压，通过协方差分析校正了年龄、BMI、服药前血压、血糖、肌酐、血钠、血钾、喝茶加盐和佛教相关活动后，两个位点的不同模型中均未发现突变与氢氯噻嗪降压效果之间的显著关联。

2.5 α-ENaC基因位点与降压效果的多元线性回归 将可能影响患者服氢氯噻嗪后收缩压下降值的因素如年龄、BMI、用药前SBP、肌酐、血糖、血钠、血钾、喝茶加盐和佛教相关活动以及各个基因位点的显性模型等引入多元线性回归方程，从不同性别来分析对收缩压和舒张压的下降值具有显著影响的因素。

表6显示男性和女性中上述多元线性回归分析的结果。结果显示，各个基因位点均未对血压值的下降产生显著影响。

表5 α-ENaC基因SNPs位点与不同性别患者氢氯噻嗪治疗后血压下降值的关联分析

3 讨论

本研究采用12.5 mg氢氯噻嗪对藏族二级以下高血压患者进行了为期1个月的治疗，收缩压和舒张压显著下降10.21 mm Hg和5.78 mm Hg，未见不良反应发生。并且四个SCNN1A基因SNP位点均未发现与血压下降值之间有显著关联。

表6 不同性别高血压患者氢氯噻嗪治疗后血压下降值的多元线性回归

据统计，藏族成年人每日摄入钠盐是WHO推荐量的4.5倍[1]，高盐饮食是其高血压重要危险因素[15]。同时，低盐干预可明显降低藏族高血压患者血压水平[16]。综上说明，盐摄入量过多和较强的盐敏感性都参与了藏族高血压的发生发展，因而，氢氯噻嗪可显著降低藏族高血压患者的血压水平。由于本研究对患者进行了补钾治疗，有效避免了低钾等氢氯噻嗪常见不良反应的发生。此外，氢氯噻嗪价格较低廉，对于经济和医疗均不发达的藏区，是理想的降压药物。

理论上讲，SCNN1A基因作为水钠代谢调节基因，其SNP可能通过影响高血压患者水钠潴留的程度，从而影响氢氯噻嗪的疗效[14]，并且ENaC本身即为氢氯噻嗪的主要作用部位[17,18]，因此，其SNP位点突变与氢氯噻嗪疗效的关联可能具有一定的意义。但在本研究中，SCNN1A的四个SNP位点均未被发现与血压下降值之间有显著关联。首先，这可能与藏族与其他种族的种族差异有关。既往，直接针对SCNN1A的SNP位点与氢氯噻嗪疗效的研究尚无。rs2228576在美国黑人中被发现对高血压具有保护作用[6,7]。也曾有针对吉首地区苗族轻中度高血压患者的研究，提示rs2228576位点A等位基因携带者，经氢氯噻嗪治疗后DBP降低幅度更大[19]。基础研究进一步证实，该位点所在的羧基末端特定序列与ENaC的泛素降解有关[8]，能减少其在细胞表面的表达，使细胞Na+流显著减少[9]，但该位点在日本人群中却并未发现与高血压无关[10]。尽管对日本人群的研究发现rs10849447突变与高血压的发生显著相关[10]，但在新疆哈萨克族人群中却并没有发现该关联[20]。提示可能由于遗传背景和环境的差异，rs2228576和rs10849447引起的水钠潴留对藏族高血压的作用有限，从而不会引起其对双克反应的差异。其次，该结果可能与rs13306613和rs3782727位于内含子，没有对ENaC通道的结构和功能产生有效影响有关。而既往针对rs13306613与血压的关联研究较少，针对的群体有限，而对rs3782727的研究资料更加缺乏。

本研究发现，小剂量氢氯噻嗪短期内可安全、有效地降低藏族1级高血压患者的血压水平，无明显不良反应；并且在该群体中并未发现位点rs2228576、rs13306613、rs rs3782727、rs10849447 突变与氢氯噻嗪疗效间存在显著关联。

致谢：感谢色达县五明佛学院、甘孜州人民医院、色达县卫生局对本研究的大力支持

[1]Zhao XS，Li SS，Ba S，et al.Prevalence，awareness，treatment and control of hypertension among herdsmen living at 4300 m in Tibet.Am J Hypertens，2012，25：583-589.

[2]Mancia G，Fagard R，Narkiewicz K，et al.2013 ESH/ESC guidelines for the management of arterial hypertension：the Task Force for the Management of Arterial Hypertension of the European Society of Hypertension（ESH） and of the European Society of Cardiology（ESC）.Eur Heart J，2013，34：2159-2219.

[3]James PA，Oparil S，Carter BL，et al.2014 evidence-based guideline for the management of high blood pressure in adults：report from the panel members appointed to the Eighth Joint National Committee（JNC 8）.JAMA，2014，311：507-520.

[4]Bruce CK.Epigenetics and the control of the collecting duct epithelial sodium channel.Semin Nephrol，2013，33：383-391.

[5]Loh SY，Giribabu N，Salleh N.Sub-chronic testosterone treatment increases the levels of epithelial sodium channel（ENaC）-α， β and γ in the kidney of orchidectomized adult male Sprague-Dawley rats.Peer J，2016，4：e2145.

[6]Ambrosius WT，Blocm LJ，Zhou L，et al.Genetic variants in the epithelial sodium channel in relation to aldosterone and potassium excretion and risk for hypertension.Hypertension，1999，34：631-637.

[7]Sugiyama T，Kato N，Ishinagaa Y，et al.Evaluation of selected polymorphisms of the Mendelian hypertensive disease genes in the Japanese population.Hypertens Res，2001，24：515-521.

[8]Butterworth MB，Edinger RS，Frizzell RA，et al.Regulation of the epithelial sodium channel by membrane trafficking.Am J Physiol Renal Physiol，2009，296：F10-24.

[9]Samaha FF，Rubenstein RC，Yan W，et al.Functional polymorphism in the carboxyl terminus of the alpha subunit of the human epithelial sodium channel.J Biol Chem，2004，279：23900-23907.

[10]Iwai N，Baba S，Mannami T，et al.Association of sodium channel alpha subunit promoter variant with blood pressure.J Am Soc Nephrol，2002，13：80-85.

[11]Jin HS，Hong KW，Lim JE，et al.Genetic variations in the sodium balance-regulating genes ENaC，NEDD4L，NDFIP2 and USP2 influence blood pressure and hypertension.Kidney Blood Press Res，2010，33：15-23.

[12]LiuF，Yang X，Mo X，et al.Associations of epithelial sodium channel genes with blood pressure：the GenSalt study.J Hum Hypertens，2015，29：224-228.

[13]李南方，徐红，周玲，等.αENaC基因T663A和T3593C多态性与新疆哈萨克族血压及血电解质相关研究.医学研究杂志，2010，39：45-49.

[14]McDonough CW，Burbage SE，Duarte JD，et al.Association of variants in NEDD4L with blood pressure response and adverse cardiovascular outcomes in hypertensive patients treated with thiazide diuretics.J Hypertens，2013，31：698-704.

[15]Huang X， Zhou Z， Liu J， et al.Prevalence，awareness，treatment and control of hypertension among China′s Sichuan Tibetan population：a cross-sectional study.Clin Exp Hypertens，2016，38：457-463.

[16]Zhao XS，Yin XJ，Li X，et al.Using a Low-Sodium，High-Potassium Salt Substitute to Reduce Blood Pressure among Tibetans with High Blood Pressure：A Patient-Blinded Randomized Controlled Trial.PLoS One，2014，9：1-8.

[17]Patel-Chamberlin M，Varasteh kia M，Xu J，et al.The role of epithelial sodium channel ENaC and the apical Cl-HCO3exchange pendrin in compensatory salt reabsorption in the setting of Na-Cl cotransporter（NCC） inactivation.PLoS One，2016，11：e0150918.

[18]Duarte JD，Zineh I，Burkley B，et al.Effects of genetic variation in H3K79 methylation regulatory genes on clinical blood pressure and blood pressure response to hydrochlorothiazide.J Trans Med，2012，10：56.

[19]徐娇霞，向波，向辉，等.SCNN1A基因多态性与氢氯噻嗪降压疗效的相关性.中国医药指南，2013，11：165-166.

[20]徐红，李南方，洪静，等.上皮细胞钠通道α亚单位基因4种单核苷酸多态性与新疆哈萨克族人原发性高血压的相关性.中国医学科学院学报，2009，31：740-745.

The association study of Alpha Subunit of the Epithelial Na+Channels（αENaC）gene SNPs with Hydrocholorozide treatment in Sichuan Tibetan hypertension patients

MENG Qing-tao，WANG Si，LIU Kai，et al.Department of Cardiovascular Disease，West China Hospital Affiliated with Sichuan University，Chengdu 610041，China

CHEN Xiao-ping，E-mail：chenxp13@aliyun.com

Objective To investigate the reaction and tolerance of the Tibetan initially-found mild hypertension patients to the small dose Hydrochlorothiazide （HCTZ）therapy，among the monks and nons living in Tibetan Autonomous Prefecture of Garzê， Sichuan province.To compare the antihypertensive effects of Hydrochlorothiazide（HCTZ）in patients with different genotypes of α-ENaC.Methods120 initially-found mild hypertensive patients who met the inclusion and exclusion criteria were surveyed and examined by questionnaire investigations，physical examinations，as well as serological tests.Moreover，their DNA were extracted from the peripheral white blood cells and amplified by the Polymerase Chain Reaction（PCR）.And then，the 4 SNP locuses（rs2228576，rs10849447，rs13306613 and rs3782727）belonging to the α-ENaC genes were identified using the Molecular Mass Spectrometry.Small dose Hydrochlorothiazide（12.5 mg qd）treatment was given to them for one month.ResultsAfter treatment，systolic blood pressure of the patients decreased significantly by 10.21 mm Hg and diastolic blood pressure reduced significantly by 5.78 mm Hg.There are 40 patients who have blood pressure≤140/90 mm Hg after HCTZ therapy，and the rate of BP control was 36.70%.Analysis of covariance showed no significant BP reduction differences among the carriers of distinct genotypes.Similarly，multiple regression analysis still found nosignificant relationship between the BP reduction and SNP locuses mutation.ConclusionIn a relatively short period，small dose Hydrochlorothiazide therapy could effectively reduce the blood pressure of the Tibetan mild hypertensive patients.However，no significant differences were discovered among the patients carrying distinct SNP locuses.

αENaC； Single nucleotide polymorphism； Monks； Tibetan； Primary hypertension；Hydrochlorothiazide

610041 四川省成都市，四川大学华西医院心血管内科

陈晓平，E-mail：chenxp13@aliyun.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2017.06.022

R544.1

A

1672-5301（2017）06-0564-06

2016-09-05）