高安路 孙阿林 李晓东 王健

基础研究

肾去交感神经术对阿霉素诱导的心衰大鼠心功能的影响

高安路 孙阿林 李晓东 王健

目的 探讨肾去交感神经术（RDN）对阿霉素诱导的心衰大鼠心功能的影响。方法 42只雄性SD大鼠随机分为对照组（n=10，腹腔注射生理盐水）、假手术组（n=16，腹腔注射阿霉素4 mg/kg，每周1次，持续6周制备心衰模型后行假RDN术）和RDN组（n=16，腹腔注射阿霉素4 mg/kg，每周1次，持续6周制备心衰模型后行RDN术）。术前及术后4周分别采用超声心动图测定大鼠心功能，ELISA法测定血清BNP水平，蛋白印迹法测定心肌组织血管紧张素（Ang）Ⅱ、胶原蛋白Ⅰ和金属基质蛋白（MMP）2的表达水平。结果 ①心功能指标LVEF、LVEDd、IVST：与本组术前比较，对照组未见统计学差异（P＞0.05），假手术组和RDN组差异均有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，除假手术组IVST外差异均有统计学意义（P＜0.05）；与假手术组比较，术前未见统计学差异（P＞0.05），术后4周除IVST外差异均有统计学意义（P＜0.05）。②血清BNP水平：术后4周假手术组和RDN组大鼠血清BNP水平明显高于对照组[（216.14±23.56）pg/ml比（42.72±8.67）pg/ml，（86.17±12.35）pg/ml比 （42.72±8.67）pg/ml]，RDN 组 BNP 水 平 明 显 低于假 手 术组[（86.17±12.35）pg/ml比（216.14±23.56）pg/ml]，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。③心肌组织 AngⅡ、胶原蛋白Ⅰ和MMP2表达水平：与对照组比较，假手术组和RDN组差异均有统计学意义（P＜0.01）；与假手术组比较，RDN组差异具有统计学意义（P＜0.01）。结论 RDN可改善阿霉素诱导的心衰大鼠心功能，其机制可能与调节AngⅡ、胶原蛋白Ⅰ和MMP2表达水平有关。

肾去交感神经术； 心力衰竭； 心肌纤维化

心肌重构中发挥根本作用的重要机制包括神经激素、炎症、氧化应激、生长因子和钙稳态失调等。心力衰竭时全身交感神经系统和肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）被激活，促进血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）和醛固酮的分泌。这种交感神经重构现象可进一步导致心室肌纤维化和基质重构，同时也会引起心房肌发生结构重构和电重构，是发生房颤甚至发生室性心律失常和心源性猝死的重要机制[1]，形成恶性循环，进一步使心功能恶化。因此，通过抑制或者中断交感神经的刺激作用在心力衰竭治疗中可能有效。目前已有部分临床试验证实，肾去交感神经术（renal sympathetic denervation，RDN）可改善难治性高血压患者的交感神经激活[2,3]。本实验通过对阿霉素诱导的心衰大鼠施行RDN术，探讨RDN对充血性心力衰竭心功能的改善作用，并阐明其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠 42 只，体质量（210±20）g，购自潍坊医学院实验动物中心，动物许可证号：SCXK（鲁）20150008。

1.2 心力衰竭动物模型的制备 将注射用盐酸阿霉素（盐酸多柔比星，浙江海正药业有限公司，批号H33021980），用生理盐水配制成2 mg/ml的溶液，按大鼠4 mg/kg体质量剂量腹腔注射，每周1次，持续6周。根据观察大鼠行为体征、测量初体重和终体重、心脏超声、BNP指标等来判定心衰模型制备是否成功。实验过程符合科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。

1.3 手术干预及实验分组 实验动物分为3组：对照组（n=10，腹腔注射生理盐水）、假手术组（n=16，腹腔注射阿霉素4 mg/kg，每周1次，持续6周，制备心衰模型后行假RDN术）和RDN组（n=16，腹腔注射阿霉素4 mg/kg，每周1次，持续6周，制备心衰模型后行RDN术）。

RDN术：将大鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉后固定于实验台上，备皮，消毒，眼科剪平行肋脊角0.5 cm剪开皮肤，钝性逐层分离，暴露肾脏，放大镜下玻璃分针小心分离肾动脉和交感神经并离断所有交感神经，涂抹青霉素粉，逐层关腹，消毒切口，包扎。

1.4 心功能测定 术前及术后4周分别采用Vevo2100型彩色多普勒超声诊断仪（探头频率16 MHz）评估大鼠心功能，测定左室射血分数（LVEF）、左室舒张末期内径（LVEDd）和室间隔厚度（IVST）。

1.5 血清BNP测定 术后4周大鼠尾静脉采血0.5～1.0 ml，静置 30 min 后，3000 rpm 离心 10 min，分离血清置于-40℃冰箱中保存，采用ELISA法严格按照说明集中检测血清BNP水平。

1.6 心肌组织AngⅡ、胶原蛋白Ⅰ和MMP2表达水平测定 术后4周，心肌组织取材，裂解，3000 rpm离心10 min，取上清液，采用蛋白印迹法严格按照BCA蛋白定量试剂说明测定蛋白定量；同时检测β-actin作为内参指标，显色、曝光后，图片经吸光度图像扫描仪（HP）扫描，经GSD8000密度扫描分析系统进行图像分析，测定各组心肌组织AngⅡ、胶原蛋白Ⅰ和MMP2与内参β-actin表达灰度的比值作为相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件对相关数据进行统计学处理。计量资料以x±s表示，组内比较采用配对t检验，组间比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 超声心动图心功能指标比较 与本组术前比较，对照组未见统计学差异（P＞0.05），假手术组和RDN组差异均有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，除假手术组IVST外差异均有统计学意义（P＜0.05）；与假手术组比较，术前未见统计学差异（P＞0.05），术后4周除IVST外差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。

表1 各组大鼠术前与术后4周LVEF、LVDd、IVST比较（±s）

表1 各组大鼠术前与术后4周LVEF、LVDd、IVST比较（±s）

注：LVEF：左室射血分数；LVEDd：左室舒张末期内径；IVST：室间隔厚度。与术前本组比较，aP＜0.01，bP＜0.05；与对照组比较，cP＜0.01，dP＜0.05；与假手术组比较，eP＜0.01，fP＜0.05

LVEF（%） LVEDd（mm） IVST（mm）术前 术后4周 术前 术后4周 术前 术后4周对照组 10 72.3±3.3 69.9±4.2 4.26±0.62 4.31±0.75 1.62±0.08 1.63±0.06假手术组 16 58.6±2.9c 49.7±3.1ac 6.14±0.93c 5.63±1.05ac 1.85±0.11c 1.65±0.20aRDN 组 16 58.1±2.5c 63.4±3.4ace 6.19±1.14c 5.24±0.87acf 1.83±0.14c 1.68±0.16bd组别 例数

2.2 血清BNP水平比较 术后4周假手术组和RDN组大鼠血清BNP水平明显高于对照组[（216.14±23.56）pg/ml比（42.72±8.67）pg/ml，（86.17±12.35）pg/ml比（42.72±8.67）pg/ml]，RDN 组大鼠血清BNP水平明显低于假手术组[（86.17±12.35）pg/ml比（216.14±23.56）pg/ml]，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。

2.3 心肌组织AngⅡ、胶原蛋白Ⅰ和MMP2表达水平 与对照组比较，假手术组和RDN组差异均有统计学意义（P＜0.01）；与假手术比较，RDN组差异具有统计学意义（P＜0.01）。见表2、图1。

表2 各组大鼠心肌组织AngⅡ、胶原蛋白Ⅰ和MMP2 相对表达量（±s）

表2 各组大鼠心肌组织AngⅡ、胶原蛋白Ⅰ和MMP2 相对表达量（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.01；与假手术组比较，bP＜0.01

组别 例数 AngⅡ 胶原蛋白Ⅰ MMP2对照组 10 1.22±0.14 0.41±0.08 0.22±0.05假手术组 16 2.04±0.20a 1.63±0.11a 1.33±0.23aRDN 组 16 1.53±0.16ab 0.76±0.09ab 0.65±0.10ab

3 讨论

心力衰竭发生时肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RASS）被激活，心肌组织内的肾素水平升高，可进一步促进水钠滞留和心肌重构的进程[4,5]，伴随着某些病理生理过程，例如心肌胶原蛋白合成增加、去甲肾上腺素释放、心脏交感神经活性增加以及凝血异常促使血栓形成。其中交感神经活性增加所致的血管紧张素亚型1（AT1）受体的激活在心衰形成相关机制中起重要作用。我们发现，应用ACEI或者ARB类药物治疗心力衰竭并不能完全阻断神经激素的过度激活，部分血管紧张素Ⅰ（AngⅠ）仍能转化成血管紧张素Ⅱ（AngⅡ），在使用大量ACEI或者ARB类药物治疗后，一部分患者的血浆醛固酮水平仍然很高，即发生了“醛固酮逃逸”现象[6,7]。因此，另辟思路，在常规药物治疗的基础上，积极尝试去除交感神经的方法并探索其作用机制可能在心衰的非药物治疗中起到关键的作用[8]。

交感神经系统（SNS）过度激活，神经末梢和肾上腺髓质释放大量肾上腺素及去甲肾上腺素进入人体血液，使血浆儿茶酚胺水平明显升高[9]，作用于心肌肾上腺素能受体，提高心肌收缩力，加快心率，从而增加心排血量[10]；但同时由于心脏后负荷增加，心肌耗氧量亦相应增加，去甲肾上腺素本身的毒副性作用在心肌细胞凋亡、心肌重构等过程中也扮演了重要的角色[11,12]。由于上述机制，心力衰竭时心排血量降低，肾灌注量不足，导致RASS系统激活，AngⅡ合成增加。AngⅡ可介导产生一系列生物学效应，如水钠潴留、血管收缩、内皮功能紊乱，促心肌细胞肥大、纤维化和凋亡等[13]。AngⅡ通过心肌细胞转录翻译表达大量的TGF-β1，增加胶原蛋白的合成，同时通过抑制胶原酶等金属蛋白酶的分泌及刺激金属基质蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）抑制剂的表达而抑制胶原蛋白的降解，在组织纤维化过程中起重要作用。AngⅡ也是一种交感激动剂，其作用于全身血管平滑肌引起血管收缩，并刺激中枢及周围交感神经系统，诱导交感活性上调。心脏成纤维细胞主要功能是产生和分泌大多数的细胞外基质蛋白及一些重要的调节因子，对于维持正常的心脏组织结构及功能具有重要意义[14]。其中胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ合成分泌过度增加是心肌纤维化的细胞生物学基础。AngⅡ具有较强的致心肌纤维化的作用，它可以通过血管紧张素Ⅱ-1型受体（angiotensinⅡtype 1 receptor，AT1R）的介导直接作用于心脏成纤维细胞，引起胶原Ⅰ、Ⅲ的增加[15]。国内相关实验研究证明，AngⅡ可显著促进心肌成纤维细胞的增殖及胶原蛋白合成，具有明显的促纤维化作用[16]。基质金属蛋白酶是一组能特异地降解细胞外基质（extracellular matrixc，ECM)）成分的Zn2+依赖的酶家族，能溶解纤维胶原，在心肌重构中起重要作用。MMP-2是血管壁细胞表达和分泌的最主要的MMP，可降解心肌基质，介导心肌重构，参与心力衰竭的发生发展过程[17]。因此，行RDN术后AngⅡ、胶原蛋白Ⅰ和MMP2表达水平可较好地反映心功能的变化。

本实验中我们对阿霉素诱导的心衰大鼠施行RDN术，观察RDN术对心功能的影响，发现施行RDN术后4周心衰大鼠心功能指标LVEF较假手术组明显增高[（63.4±3.4）%比（49.7±3.1）%]，LVEDd 降低[（5.24±0.87）mm 比（5.63±1.05）mm]，血清 BNP 水平明显降低 [（86.17±12.35）pg/ml比（216.14±23.56）pg/ml]，表明施行 RDN 术可明显改善心衰大鼠心功能。为探求其可能机制，我们通过测定心肌组织AngⅡ、胶原蛋白Ⅰ和MMP2表达水平发现施行RDN术后上述指标明显降低，提示RDN术可改善阿霉素诱导的心衰大鼠心功能，其机制可能与调节AngⅡ、胶原蛋白Ⅰ和MMP2表达水平有关。

（本文图片见后插二）

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Effects of renal sympathetic denervation on cardiac function in rats with Adriamycin induced heart failure

GAO An-lu＊，SUN A-lin，LI Xiao-dong，et al.＊Graduate Department of Weifang Medical University，Weifang 261053，China

WANG Jian，E-mail：13953670058@163.com

Objective To investigate the effect of renal sympathetic denervation on cardiac function in rats with adriamycin induced heart failure.Methods42 male SD rats were randomly divided into three groups：control group（n=10，Intraperitoneal injection of normal saline）；Sham operation group（n=16，Intraperitoneal injection of doxorubicin 4 mg/kg，once a week,for 6 weeks to prepare the model of heart failure after sham RDN）；RDN group（n=16，Intraperitoneal injection of doxorubicin 4 mg/kg，1 times per week，for 6 weeks to prepare the model of heart failure after RDN）.The cardiac function was measured by echocardiography before and 4 weeks after operation，ELISA method for the determination of serum BNP levels.The expression level of angiotensin（Ang）Ⅱ，collagen Ⅰ and metal matrix protein（MMP）2 was determined by Western blot.Results⑴Heart function index LVEF，LVEDd，IVST：compared with the preoperative group，the control group was not statistically significant（P＞0.05）.There were statistically significant differences between the sham operation group and the RDN group（P＜0.05）.Compared with the control group，the difference was statistically significant（P＜0.05）in the sham operation group （IVST）.Compared with the sham operation group，there was no significant statistical significance（P＞0.05）before operation.There were statistically significant（P＜0.05）in addition to IVST 4weeks after surgery. ⑵Serum BNP level：The serum levels of BNP in sham operated group and RDN group were significantly higher than those in control group after 4 weeks[（216.14±23.56）pg/ml vs （42.72±8.67）pg/ml，（86.17±12.35）pg/ml vs （42.72±8.67）pg/ml].The level of serum BNP in RDN group was significantly lower than that in sham operation group [（86.17±12.35）pg/ml vs （216.14±23.56）pg/ml].The difference was statistically significant（P＜0.01）.⑶The expression level of AngⅡ，collagen Ⅰ and MMP2 in cardiac muscle：Compared with the control group，the difference was statistically significant between sham operation group and RDN group（P＜0.01）.Compared with sham operation，the difference of RDN group was statistically significant（P ＜0.01）.ConclusionRDN can improve cardiac function in rats with adriamycin induced heart failure.The mechanism may be related to the regulation of AngⅡ，collagenⅠ and MMP2 expression levels.

Renal sympathetic denervation； Heart failure； Myocardial fibrosis

山东省潍坊市卫计委项目（项目编号：2016wsjs103）

261053 山东省潍坊市，潍坊医学院研究生部（高安路、李晓东）；潍坊市人民医院重症医学科（孙阿林），心内科（王健）

王健，E-mail：13953670058@163.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2017.06.023

Q95-33；R541.6

A

1672-5301（2017）06-0570-04

2017-01-14）