付冰

基础研究

丹参酮ⅡA调控Cys C/Wnt信号通路抑制大鼠心肌肥厚的研究

付冰

目的 探讨丹参酮ⅡA对自发性高血压大鼠心肌肥厚的抑制作用，及其与Cys C/Wnt信号通路的关系。方法 纳入20只18周龄自发性高血压大鼠随机分为心肌肥大组和丹参酮组，每组10只；同时，纳入10只同周龄健康大鼠为健康对照组。Western blot方法检测3组大鼠心肌组织中eNOS和Cys C/Wnt信号通路相关蛋白的表达。结果 心肌肥大组的LVW/HW指数和左室长轴值均显著高于空白对照组，与心肌肥大组相比，丹参酮处理组LVW/HW指数和左室长轴值均有明显下降（P＜0.05）。与空白对照组相比，心肌肥大组大鼠心肌细胞肿胀，内容物成颗粒状，部分细胞核表现出核固缩。与心肌肥大组相比，丹参酮处理组心肌细胞肿胀程度有所好转，单个心肌细胞面积有所减小。与空白对照组相比，心肌肥大组大鼠心肌组织内eNOS和p-eNOS（Ser1177）表达显著减少，而Cys C和Wnt蛋白表达显著增加；丹参酮给药后eNOS和peNOS（Ser1177）表达较心肌肥大组显著增加（P＜0.05），而 Cys C和 Wnt蛋白表达显著下降（P＜0.05）。结论丹参酮ⅡA能够改变大鼠心脏肥厚指数，通过抑制Cys C/Wnt信号通路起到抑制大鼠心肌肥厚的作用。

丹参酮ⅡA； 心肌肥大； 自发性高血压； Cys C/Wnt信号通路

心肌肥厚是心脏由于不堪压力负荷增加及神经体液因子变化引起的一种适应性反应，是高血压导致的主要器官损害之一，易导致心源性死亡[1]。Wnt蛋白是一类在多种细胞中均有表达的分泌型蛋白，Wnt信号通路便是因启动Wnt蛋白得名，也是最重要的细胞信号传导通路，在细胞增殖、分化、凋零等机体发育中起到调节作用[2]。半胱氨酸蛋白酶抑制剂C（Cystatin C，Cys C）是心脏病事件的早期危险标志，Cys C/Wnt信号通路参与了心肌细胞肥厚的过程[3]。丹参是一种传统草本植物，目前已广泛用于治疗于心脑血管疾病，具有心肌保护功能，丹参酮ⅡA（tanshinoneⅡA）是丹参中最具代表性的丹参酮，其能抑制左心室心肌细胞凋亡与肥大，对于心肌肥厚有抑制作用[4,5]。本研究主要通过对比方式，检测分析丹参酮ⅡA通过调节Cys C/Wnt信号通路，抑制高血压大鼠心肌肥厚的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组和给药方法 实验对象为18周龄雄性自发高血压大鼠（SHR大鼠）及Wistar-Kyoto（WKY）大鼠，体重（265.41±24.55）g，购自中国科学院动物研究所，清洁级。实验大鼠在实验前正常进食进水，在（25±1）℃和50%的湿度条件下饲养4周。将20只SHR大鼠随机分为高血压心肌肥大组（S17，n=10）和丹参酮组（S17，n=10），同时选取同周龄 Wistar-Kyoto（WKY）健康大鼠 10只（W17，n=10）作为空白对照组。丹参酮组按大鼠体重2 mg/kg丹参酮ⅡA给药，每周灌胃1次；空白对照组作为正常对照，该组大鼠接受等量生理盐水灌胃；心肌肥大组作为模型对照，给予等量生理盐水灌胃。三组大鼠培养4周后行麻醉处死提取心肌组织和血清，保藏于-80℃冰箱用于实验。实验严格按照国家动物实验要求规则执行，得到南京医科大学动物伦理协会的批准，在实验过程中尽最大可能善待动物，减少动物的痛苦。

1.2 心肌肥大指数的测量 测量心肌肥大指数需处死大鼠后打开胸腔，取出心脏并剪去周围血管，生理盐水清洗3次，滤纸吸水后称大鼠全心湿重（heart weight，HW）；随后按顺序分离大血管、左右心房和右心室，小心剪去心房及右室游离壁，仅保留左心室游离壁，清洗3次后再次吸干水分，称左室湿重（left ventricular weight，LVW）。左心室长轴（left ventricular long axis）为心尖与主动脉瓣间的距离。左心室长轴和左心室与全心的重量比值（LVW/HW）可作为反映心肌肥大的指标。

1.3 大鼠左心室心肌病理形态学观察 取出大鼠左心室组织样本，用4%多聚甲醛进行固定，PBS冲洗后乙醇脱水，石蜡包埋，冷冻切片，再进行乙醇脱蜡，最终制成组织切片。将制好的切片置于HE溶液中染色5 min，冲洗后再将组织切片放入 0.5%的伊红酒精溶液中染色 2 min，再经过乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，并运用 Nikon ECLIPSE 80i生物显微镜进行观察，随机选择5视野进行拍照。运用全自动形态测量仪（HPIAS21000，中国）对左心室心肌细胞直径和面积进行测量，每张片测量3次并计算出平均值。

1.4 Western blot 取出大鼠心肌组织，用匀浆机捣碎，4℃、12 000 r/min离心10 min，收集上清液，使用BCA试剂盒检测待测蛋白浓度。将60 μg总蛋白进行凝胶电泳，70 V、120 min后转移到PVDF膜上，5%BSA室温封闭1.5 h，室温孵育一抗（Cys C抗体 1∶3000，Wnt抗体 1∶3000，eNOS 抗体 1∶3000，GAPDH 抗体 1∶3000）2 h，4℃过夜。抗体均购于美国Abcam公司。TBST缓冲液洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG（1∶5000）室温孵育1.5 h。条带经ECL化学发光试剂染色后显影，蛋白表达的灰度使用Image软件扫描分析。

1.5 统计学方法 使用SPSS 19.0统计软件进行相关数据分析。计量资料用±s表示，采用t检验，组间差异采用ANOVA单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丹参酮对自发性高血压大鼠心肌肥大指数的影响 各组大鼠心肌肥大指数如表1所示。心肌肥大组的LVW/HW指数和左室长轴值均显著高于空白对照组（P＜0.05）；与心肌肥大组相比，丹参酮组LVW/HW指数和左室长轴值均有所下降，且差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组大鼠心肌肥大指数的比较（±s）

表1 各组大鼠心肌肥大指数的比较（±s）

注：与空白对照组相比，aP＜0.05；与心肌肥大组相比，bP＜0.05

组别 例数 LVW/HW 左心室长轴空白对照组 10 0.58±0.10 7.33±0.23心肌肥大组 10 0.79±0.13a 12.56±0.36a丹参酮组 10 0.60±0.12ab 7.41±0.31ab

2.2 各组大鼠心肌病理组织形态学的比较 由图1可见，与空白对照组相比，心肌肥大组大鼠心肌细胞肿胀、排列稀疏且单个心肌细胞面积明显增加，内容物成颗粒状，部分细胞核表现出核固缩。而丹参酮处理组部分改善了这种效果，与心肌肥大组相比，丹参酮处理组心肌细胞肿胀程度有所好转，单个心肌细胞面积有所减小。

2.3 丹参酮对自发性高血压大鼠心肌中Cys C和Wnt蛋白表达的影响 Western Blot结果显示（图2），心肌肥大组大鼠心肌组织中Cys C和Wnt蛋白表达明显高于对照组（P＜0.05）；而丹参酮组与心肌肥大组相比，Cys C和Wnt蛋白表达水平明显下调（P＜0.05），与空白对照组相比蛋白表达水平略高但未见统计学差异。丹参酮可能是通过抑制Cys C/Wnt信号通路起到对大鼠心肌的保护作用。

2.4 各组大鼠心肌肥厚心肌中eNOS表达及其eNOS Ser1177位点磷酸化水平的变化 Western blot法测定大鼠心肌组织中eNOS和p-eNOS水平，结果显示（图3），与空白对照组相比，心肌肥大组大鼠心肌组织内eNOS和p-eNOS（Ser1177）表达明显降低（P＜0.05）；与心肌肥大组相比，丹参酮组eNOS和p-eNOS（Ser1177）表达显著增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。心肌肥大组大鼠eNOS蛋白受到抑制，丹参酮能显著提高心肌组织内eNOS（Ser1177）位点的磷酸化水平，使eNOS的活性增强。

3 讨论

高血压是最为常见的心血管疾病。近年来我国高血压发病率呈现上升趋势。心肌肥厚作为高血压导致的主要器官损害之一，发生率高，且易因为血氧供给不平衡引发心力衰竭、猝死等，主要治疗方式是外科手术治疗[1,6]。中药丹参所含的溶脂性成分丹参酮ⅡA对减少心肌梗死、改善心肌缺血有重要意义[5,7]。本研究主要探讨丹参酮ⅡA通过调控Cys C/Wnt信号通路抑制大鼠心肌肥厚的作用。

将本实验研究对象大鼠分为心肌肥大组、丹参酮组，在测量心肌肥厚指数后，通过Western blot方法检测心肌组织中eNOS蛋白和Cys C/Wnt信号通路相关蛋白的表达。本研究结果提示，丹参酮能改变大鼠心肌肥厚指数，通过抑制Cys C/Wnt信号通路从而起到抑制心肌肥厚的作用。心肌肥厚是一个长期的过程，所以治疗需要一些疗效好但副作用小的药物。丹参酮ⅡA为逆转心肌肥厚提供了新的分子生物学机制，可有效抑制Cys C/Wnt信号通路对细胞增殖分化、肿瘤发生及血管形成的作用[8,9]。蒋嘉辉等[10]在研究中提到，在心肌肥大病理形成过程中有多种信号通路参与，但是通过抑制Wnt信号对心肌肥大有治疗作用。丹参酮ⅡA能抑制心肌肥厚的发生，能通过调节蛋白来调节心肌细胞的凋亡水平，降低心肌细胞凋亡的速度[11]。有研究发现，通过检测心肌组织中相关蛋白，发现上调Bcl-2蛋白，下调Bax、P53蛋白都对心肌细胞的凋亡速度有影响，丹参酮ⅡA能抑制左室心肌肥厚发生[12,13]。严丽在丹参酮ⅡA抑制高血压大鼠心肌肥厚研究中发现，其能抗击心肌细胞的Ca2+内流，降低心肌肿瘤细胞及原癌细胞的表达。通过对比的方式，发现丹参酮ⅡA能抑制左心室心肌肥厚的进程，对治疗心肌肥厚提出了新的概念和方式[14,15]。这进一步说明丹参酮对抑制心肌肥厚进程的作用，在治疗心肌肥厚上提出了新的可能性。在丹参酮对大鼠心肌肥厚指数观测中发现，丹参酮组的左室增长值有所下降，但是丹参酮的高低剂量之间没有明显差异。丹参酮组的Cys C和Wnt蛋白含量比心肌肥大组明显下降。心肌肥大组的eNOS蛋白表达受到抑制，丹参酮能提高磷酸化水平，使其活性增强。

综上所述，本研究发现，丹参酮ⅡA能通过抑制Cys C/Wnt信号通路及其下游相关因子抑制大鼠心肌肥厚。本研究对于探索治疗心肌肥厚的新途径，开发及利用中医药资源具有重要的开拓意义。

（本文图片见后插一）

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TanshinoneⅡA regulates Cys C/Wnt signaling pathway to inhibit myocardial hypertrophy in rats

FU Bing.Department of Cardiovascular，The Second Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China

Objective To investigate the inhibitory effect of tanshinoneⅡA on myocardial hypertrophy in spontaneously hypertensive rats and its relationship with Cys C/Wnt signaling pathway.MethodsSpontaneously hypertensive rats of 18 weeks（n=20）were randomly divided into two groups：myocardial hypertrophy group and tanshinone group，10 rats in each group；meanwhile，10 healthy rats of the same age were selected as the normal control group.The expression of eNOS and Cys C/Wnt signaling pathway related proteins were determined by Western blot in three groups.ResultsCompared with the blank control group，the LVW/HW index and the left ventricular long axis value was significantly increased in the myocardial hypertrophy group；compared with the myocardial hypertrophy group，the LVW/HW index and the left ventricular long axis value of tanshinone group were significantly decreased （P＜0.05）.Furthermore，compared with the blank control group，the myocardial cells of rats with myocardial hypertrophy were swelled，the contents were granular，and some nuclei showed pyknosis.Compared with the myocardial hypertrophy group，the swelling degree of the myocardial cells in the tanshinone group was improved，and the area of myocardial cells was decreased.The results of Western blot showed that the expression of eNOS and p-eNOS （Ser1177）in myocardial tissue of rats with myocardial hypertrophy was significantly decreased，and the expression of Cys C and Wnt protein increased significantly（P＜0.05）.Furthermore，expression of eNOS and p-eNOS （Ser1177）were obviously increased，and the expression of C and Wnt protein decreased significantly after tanshinone treatment when compared with the myocardial hypertrophy group （P＜0.05）.ConclusionTanshinone ⅡA can change the cardiac hypertrophy index of rats，and inhibit the Cys C/Wnt signaling pathway to inhibit myocardial hypertrophy in rats.

Tanshinone ⅡA； Myocardial hypertrophy； Spontaneously hypertension； Cys C/Wnt signaling pathway

110032 辽宁省沈阳市，辽宁中医药大学附属第二医院心血管科

10.3969/j.issn.1672－5301.2017.06.024

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2017）06-0574-04

2017-02-27）