刘钦成，张梓朗，潘润华，刘宁，韩晓玉，郭凌宏，王春明，廖彩仙

(南方医科大学南方医院，广州 510515)

大鼠CD90+Lin-骨髓细胞诱导分化为肝细胞过程中Klf4、Nanog基因的表达及启动子区甲基化观察

刘钦成，张梓朗，潘润华，刘宁，韩晓玉，郭凌宏，王春明，廖彩仙

(南方医科大学南方医院，广州 510515)

目的 观察大鼠CD90+Lin-骨髓细胞诱导分化为肝细胞过程中Klf4、Nanog基因表达及启动子区CpG位点的甲基化变化。方法 大鼠CD90+Lin-骨髓细胞在体外用25 μg/L重组人肝细胞生长因子和0.1 nmol/L地塞米松诱导其分化，在诱导第0、7、14天分别提取细胞DNA和RNA。采用实时荧光定量PCR法检测Klf4、Nanog基因mRNA，甲基化特异性PCR法观察Klf4、Nanog基因启动子区CpG位点甲基化。结果 与诱导第0天比较，第7、14天Klf4 mRNA相对表达量降低(P均<0.05)；与诱导第0天比较，第7、14天Nanog mRNA相对表达量均降低(P均<0.05)。与诱导第0天比较，诱导第7天Klf4启动子区第1、2个CpG位点甲基化频率升高(P均<0.05)；与诱导第7天比较，诱导第14天Klf4启动子区第1个CpG位点甲基化频率升高，第2、3个CpG位点甲基化频率降低,P均<0.05。与诱导第0天比较，诱导第7天Nanog启动子区第1个CpG位点甲基化频率降低，第2个CpG位点甲基化频率升高，P均<0.05；与诱导第7天比较，诱导第14天Nanog启动子区第1个CpG位点甲基化频率升高，第2个CpG位点甲基化频率降低，P均<0.05。结论 大鼠CD90+Lin-骨髓细胞在体外诱导向肝细胞分化过程中，Klf4、Nanog基因表达随诱导时间增加呈现先下降后回升趋势，两者启动子区CpG位点甲基化程度随诱导时间增加出现不同程度变化；Klf4和Nanog基因启动子区CpG位点的甲基化变化不仅会影响Klf4、Nanog基因的表达，而且起到重要的调控作用。

骨髓间充质干细胞；CD90+Lin-骨髓细胞；Nanog基因；Klf4基因

CD90+Lin-骨髓细胞具有分化形成肝细胞的潜能已得到实验研究和临床试验证实[1，2]，但其向肝细胞分化的表观遗传学调控机制尚不清楚。本课题组潘润华等[3]曾对大鼠骨髓间充质干细胞在体外诱导向肝细胞分化过程中OCT4基因表达及其启动子区甲基化变化进行观察，发现OCT4表达量和启动子区甲基化频率随分化进程不同而变化。而Oct4与Klf4、Nanog等是一组多潜能性基因，在维持干细胞的多能性方面均起着重要作用[4，5]。本研究观察了大鼠CD90+Lin-骨髓细胞诱导分化为肝细胞过程中Klf4、Nanog基因表达及其启动子区甲基化变化，以期从多角度认识骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的表观遗传学调控机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 高糖DMEM F12培养基(美国Hyclone公司)；……