何 伟 徐升强 刘少平 王永涛 王月芹 苏斌涛 胡志敏,#

N-钙黏蛋白抗体对毛霉菌丝感染人肺微血管内皮细胞组织因子和血管性血友病因子表达水平的影响*

何 伟1徐升强2刘少平3王永涛2王月芹2苏斌涛2胡志敏2,#

目的：观察毛霉菌丝对人肺微血管内皮细胞(HPMVEC)分泌凝血因子的影响及N-钙黏蛋白抗体的干预作用。方法：取增殖期HPMVEC，分为毛霉菌丝感染模型组(毛霉菌丝组，用1×104CFU毛霉菌丝与HPMVEC在37℃、5% CO2饱和湿度下共培养12h)、人N-钙黏蛋白单克隆抗体干预组[N-钙黏蛋白抗体组，在HPMVEC与毛霉菌丝共培养前，先用该抗体(1mg/ml)与HPMVEC室温作用1h，之后按毛霉菌丝组操作]和空白对照组(用无菌去离子水代替毛霉菌丝悬液，且不行N-钙黏蛋白抗体作用，按毛霉菌丝组方法平行实验)。分别于0h、1h、2h、6h、12h收集各组培养上清液，采用ELISA检测其组织因子(TF)和血管性血友病因子(vWF)水平。结果：组内比较，毛霉菌丝组TF和vWF水平随培养时间增加而升高(均P<0.05或P<0.01)；组间比较，毛霉菌丝组各时相TF和vWF水平均较空白对照组升高(P<0.05或P<0.01)，而N-钙黏蛋白抗体组各时相TF和vWF水平均较毛霉菌丝组显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论：毛霉菌丝感染HPMVEC所致TF、vWF水平升高可被N-钙黏蛋白单克隆抗体有效下调，或可用于防治由毛霉菌丝感染引起的血管内皮细胞损伤和血栓形成。

N-钙黏蛋白；不规则毛霉；人肺微血管内皮细胞；组织因子；血管性血友病因子

人体免疫功能损伤、介入性临床诊疗、大剂量糖皮质激素及广谱抗生素的应用等，使毛霉菌感染发病率呈上升趋势[1-5]，也是造成较多疾病疗效差、病死率高的原因之一[1,2]。毛霉菌丝黏附血管内皮细胞，引起内皮细胞损伤并促进血栓形成，是毛霉菌丝血管侵袭性损害的关键环节[1-3]。N-钙黏蛋白(N-Cadherin)作为内皮细胞膜糖蛋白，能介导白色念珠菌黏附于血管内皮细胞并被内皮细胞吞噬[6,7]，引起一系列包括凝血功能紊乱等病理变化。下调或拮抗N-钙黏蛋白的介导作用可以阻止或减少由真菌菌丝感染引起的凝血功能增强和血栓形成[6,8]。本文采用N-钙黏蛋白单克隆抗体预处理人肺微血管内皮细胞(Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cell,HPMVEC)后，检测毛霉菌丝与HPMVEC共培养12h内不同时相培养上清中组织因子(Tissue Factor,TF)和血管性血友病因子(von Willebrand Factor,vWF)水平变化，为N-钙黏蛋白单克隆抗体干预治疗毛霉菌感染提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料与试剂

HPMVEC由武汉大学中南医院医学科学研究中心提供；不规则毛霉菌株由湖北省感染性皮肤病研究中心临床分离[4]。N-钙黏蛋白单克隆抗体(批号：ab76011)购自美国Abcam公司；沙堡弱培养基(批号：SAP-160120D)购自广州迪景微生物科技有限公司；ELISA试剂盒(批号：HM11905、HM10062)和青霉素-链霉素双抗(批号：J130071)购自武汉华联科生物技术有限公司；胎牛血清(批号：13011-8611)购自杭州四季青公司；改良杜氏伊格尔高糖培养基(DMEM，批号：11816005)购自美国Gibco公司；AccumaxTM细胞解离液(批号：6V2916A)购自上海信裕生物公司；毛霉菌丝DNA提取试剂盒(批号：077K6133)购自美国Sigma公司。完全培养基(青霉素100U/ml、链霉素10μg/ml双抗及灭活10%胎牛血清加至含L-谷氨酰胺的DMEM培养基配制而成)。

1.2 HPMVEC扩增培养

自液氮罐中取出HPMVEC置37℃水浴箱中复苏后，接种于25ml完全培养基，37℃、5% CO2、饱和湿度培养，隔天传代1次。取第3代HPMVEC，用3ml AccumaxTM细胞解离液处理5min，加入5ml完全培养基中和后调节细胞浓度至1×105CFV/ml作为实验细胞悬液。取24孔培养板，每孔加入完全培养基800μl，再加入200μl HPMVEC悬液混匀，使成终浓度为1×104CFV/孔，继续培养至细胞贴壁生长80%，呈多角形或长梭形时(图1)弃去培养基，PBS洗3次备用。

图1 HPMVEC贴壁生长，呈多角形或长梭形(×400)

1.3 毛霉菌丝的制备与鉴定

取毛霉菌株接种于沙堡弱培养基，37℃培养7天后用细胞刮匙轻轻刮取菌落表面，用灭菌PBS冲洗，5000rpm离心10min收集毛霉菌丝，按照毛霉菌丝DNA提取试剂盒说明书提取毛霉菌丝DNA，将扩增内转录间隔区(ITS)产物送北京奥科生物技术有限责任公司纯化及测序，经NCBI核苷酸序列比对检索，其与基因库中不规则毛霉菌(CBS 103.93)株序列同源性为98%。遂用无血清DMEM将此毛霉菌丝稀释至1×105CFU/ml，4℃保存备用。

1.4 实验分组及处理

毛霉菌丝组：取上述制备好的HPMVEC，加入1×105CFU/ml的毛霉菌丝悬液100μl，再加入100μl完全培养基于24孔板，混匀后菌丝终浓度为1×104CFU/孔，置37℃、5% CO2、饱和湿度共培养(平行设置3孔)，每隔1h观察菌丝生长状态及HPMVEC形态。N-钙黏蛋白抗体组：HPMVEC与毛霉菌丝共培养前，以1∶100的抗人N-钙黏蛋白单克隆抗体(1mg/ml)与HPMVEC室温作用1h，吸出抗体，PBS洗3次，之后操作同毛霉菌丝组。空白对照组：用无菌去离子水代替毛霉菌丝悬液且不使用N-钙黏蛋白抗体孵育，余按毛霉菌丝组方法平行操作。

1.5 TF和vWF水平检测方法

分别收集各组共培养0h、1h、2h、6h、12h上清液，-80℃存储批检。采用ELISA严格按照试剂盒说明书步骤进行操作。测量所有样本光密度(OD)值，并以完全培养液作为空白对照。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 毛霉菌丝与HPMVEC共培养后细胞形态的变化

毛霉菌丝与HPMVEC共培养1h后即可黏附于细胞表面，至第12h，可见HPMVEC肿胀变形，部分细胞坏死，见图2。

图2 毛霉菌丝与HPMVEC共培养对细胞形态的变化

2.2 各组TF水平比较

组内比较：空白对照组各时相TF水平差异无统计学意义(P>0.05)，毛霉菌丝组和N-钙黏蛋白抗体组差异有显著统计学意义(P<0.01)，且均随共培养时间增加而升高(P<0.01)。毛霉菌丝组TF水平从培养1h到12h渐次显著升高(t=3.49、36.32、16.34、20.96，P均<0.01)。N-钙黏蛋白抗体组1h与0h差异无统计学意义(P>0.05)，从2h到12h亦渐次升高(t=30.24、11.80、17.05， 均P<0.01))。组间比较：共培养0h的各组TF水平差异未见统计学意义(P>0.05)，1h-12h各组TF水平差异均有统计学意义(P<0.01)。毛霉菌丝组各时相TF水平明显高于空白对照组(t=3.74、39.81、67.79、130.02，P均<0.05或P<0.01)。N-钙黏蛋白抗体组各时相TF水平均较毛霉菌丝组显著降低(t=-3.02、-10.56、-15.93、-30.52，P<0.05或P<0.01)。见表1。

表1 各组不同时相TF水平比较均=3，ng/L)

注：组内：与0h比较，1)P<0.01；与1h比较，2)P<0.01；与2h比较，3)P<0.01；与6h比较，4)P<0.01；组间：与空白对照组比较，5)P<0.05，6)P<0.01；与毛霉菌丝组比较，7)P<0.05，8)P<0.01。

2.3 各组vWF水平比较

组内比较：空白对照组各时相vWF水平差异无统计学意义(P>0.05)，毛霉菌丝组和N-钙黏蛋白抗体组差异有显著统计学意义(P<0.01)，且均随共培养时间增加而升高(P<0.01)。毛霉菌丝组vWF水平从培养1h到12h渐次显著升高(t=3.04、8.85、22.32、17.47，P<0.05或P<0.01)。N-钙黏蛋白抗体组1h与0h差异无统计学意义(P>0.05)，从2h到12h亦渐次升高(t=3.24、17.80、17.25，P<0.05或P<0.01)。组间比较：共培养0h的各组vWF水平差异未见统计学意义(P>0.05)，1h-12h各组vWF水平差异均有统计学意义(P<0.01)。毛霉菌丝组各时相vWF水平明显高于空白对照组(t= 3.06、10.55、47.52、43.35，P<0.05或P<0.01)。N-钙黏蛋白抗体组各时相vWF水平均较毛霉菌丝组显著降低(t=-3.16、-8.91、-15.25、-19.59，P均<0.05)。见表2。

表1 各组不同时相vWF水平比较均=3，ng/L)

注：组内：与0h比较，1)P<0.01；与1h比较，2)P<0.01；与2h比较，3)P<0.01；与6h比较，4)P<0.01；组间：与空白对照组比较，5)P<0.05，6)P<0.01；与毛霉菌丝组比较，7)P<0.05，8)P<0.01。

3 讨 论

正常生理条件下，血管内皮细胞具有抗血栓和促血栓形成双重功能，以抗血栓形成为主。毛霉菌丝能黏附并损伤人血管内皮细胞结构和功能[8]，如使凝血介质释放增加等。TF释放增加能激活内源性凝血因子X和Ⅻ，促进凝血酶原复合物的形成，并通过一系列酶促反应启动外源性凝血系统，导致血液凝固或血栓形成[9]。vWF主要介导血小板与血管内皮下胶原纤维黏附，亦可促进血栓形成。本资料证实，HPMVEC与毛霉菌丝共培养1h，毛霉菌丝即黏附于HPMVEC，致细胞间隙增大及培养上清中TF、vWF水平显著升高，继续培养至12h，HPMVEC损伤加重，出现细胞肿胀坏死；培养上清中TF、vWF水平也随培养时间延长而明显升高。表明毛霉菌感染可引起机体凝血功能异常增加，是血栓形成的危险因素。

毛霉菌丝侵入血管内皮细胞导致凝血功能增强及至血栓形成的机制目前尚不明确，有研究[10，11]认为可能与内皮细胞膜表面蛋白受体对毛霉菌丝的结合转运有关；而N-钙黏蛋白在此起到重要作用，因其表达于血管内皮细胞膜表面，可调节钙介导的细胞间黏附，参与细胞间的识别和信号传导机制。因此，下调或拮抗N-钙黏蛋白的介导作用既可验证其病理机制，更能减少或阻止毛霉菌感染引起的凝血功能增强或血栓形成。故本研究采用人N-钙黏蛋白单克隆抗体先行HPMVEC封闭处理后再与毛霉菌丝共培养，结果显示培养上清TF、vWF水平比未先行处理的毛霉菌丝组显著降低，进一步说明N-钙黏蛋白参与了毛霉菌丝的致病过程，采用N-钙黏蛋白单克隆抗体可抑制毛霉菌丝的病理效应。

综上，毛霉菌丝感染HPMVEC可促进其血栓介质的分泌和释放，是血栓形成的危险因素；N-钙黏蛋白单克隆抗体通过拮抗N-钙黏蛋白，可有效下调TF、vWF表达水平，从而起到保护血管内皮细胞、防治血栓形成的作用。

本文第一作者简介：

何 伟(1977-)，男，汉族，硕士，主管药师，主要从事临床药学工作

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Effect of N-cadherin Antibody on TF and vWF Expression by HPMVEC Infected with Mucor Irregularis

HE Wei1, XU Sheng-qiang2, LIU Shaoping3, WANG Yong-tao2, WANG Yue-qin2, SU Bin-tao2, HU Zhi-min2,#

1Department of Pharmacy;2Department of Laboratory Medicine,Wuhan No.1 Hospital,Wuhan 430022,China;3Center of Medicine Science Research, Zhongnan Hospital of Wuhan University,Wuhan 430071, China；#

Objective: To investigate the effect of mucor hypha on human pulmonary microvascular endothelial cell (HPMVEC) and the intervention of N-cadherin antibody. Method: The proliferative phase of HPMVEC, divided into mucor infection model group (mucor hypha group, 1×104CFU mucor hypha and HPMVEC co-culture at 37℃,5% CO2and saturated humidity for 12h )，N-cadherin monoclonal antibody intervention group (N-cadherin antibody group, HPMVEC and 1mg/ml N-cadherin antibody co-culture at room temperature for 1h, before the infection of mucor hypha, then followed by mucor hypha group operation) and blank control group (sterile deionized water instead of mucor hypha,and the absence of the N-cadherin antibody, then followed the mucor hypha group method of parallel experiment. The supernatant of each group was collected at 0h, 1h, 2h, 6h and 12h, and the levels of TF and vWF were detected by ELISA. Results: Comparison with groups, the levels of TF and vWF secreted in the supernatants of the mucor hypha group were significantly increased as time-dependent(P<0.05 orP<0.01). Comparison between groups, the levels of TF and vWF secreted in the supernatants of the mucor hypha group were sig-nificantly higher than the blank control group at each time point(P<0.05 orP<0.01), and after incubated with N-cadherin monoclonal antibody, the levels of TF and vWF released in the supernatants were significantly lower than the untreated mucor hypha group at each time point(P<0.05 orP<0.01).Conclusion: The increased level of TF and vWF induced by mucor hypha infected with HPMVEC, which can be effectively down-regulated by N- cadherin monoclonal antibody,it suggested the N-cadherin monoclonal antibody can be used to prevent the injury and thrombosis of vascular endothelial cells caused by infection of mucor hypha.

N-cadherin; Mucor Irregularis; HPMVEC; TF; vWF

湖北省卫计委科研项目(WJ2015MB239)；武汉市卫计委科研项目(WX14D02，WZ16D07)

湖北省武汉市第一医院，武汉 430022；1药学部；2检验科；3武汉大学中南医院医学科学研究中心；#

，E-mail:mycohu@163.com

本文2017-02-16收到，2017-05-30修回

R363.2

A

1005-1740(2017)03-0026-05