谢 放，夏樱霞，苏强军，UWITUGABIYE Vestine，陈照禾，周 刚

(兰州交通大学 化学与生物工程学院，甘肃 兰州 730070)

中国被毛孢被大多数学者认为是冬虫夏草菌的无性型[1-3]。在实验室条件下培养时经常在典型的基内菌丝表面或边缘长出密集的钮状菌丝团和气生菌丝。通过观察实验室人工培养的中国被毛孢长出原基的现象发现，基内菌丝表面出现的菌丝团生长一定时间后可转变为针头状原基，但当气生菌丝出现后该生物学过程不再发生。目前，三种菌丝的超显微特征和产生机制未见报道。由于以往研究的中国被毛孢菌种大多是由冬虫夏草经组织分离而获得的[4]，形态差异明显的气生菌丝究竟是杂菌或其他因素的影响无法确证。经组织分离获得的菌株材料，通过挑取单菌丝方法进行纯化的难度大，要排除杂菌因素，必须是单孢分离方法获得的纯化菌种才可以进行研究。本研究采用光斑标记法[5]分离纯化得到单孢菌株，以保证菌种的可靠性，从而排除杂菌可能的干扰。

在常见的食用菌栽培中，子实体发生的菌丝变化已经研究清楚，菌丝需经过扭结、针头状钮结、菌蕾等过程才可形成子实体[6]。而中国被毛孢形成子实体的过程还没有明确，培养过程中出现的菌丝团扭结是否都会发育成针头状原基、菌蕾等结构仍有待研究[7]。本实验通过对单孢纯化方法获得的中国被毛孢菌株生长发育过程中的3种形态菌丝进行扫描电镜观察，掌握不同菌丝的形态特征，了解其整个生长发育过程，排除杂菌干扰的可能，为今后人工培养过程中促进菌丝分化出原基进而形成子实体提供指导，同时对更深入研究菌丝发育机理和调控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 冬虫夏草单孢菌株的采集与分离

2019年5月从甘肃天祝藏族自治县带土采集完整的新鲜冬虫夏草，于实验室16～18℃中培养，使其进一步发育成熟并弹射子囊孢子。当子实体上的子囊壳表面出现白色纤维状孢子时，将灭菌玻璃纸袋套于子实体以收集子囊孢子，每3 d更换1次玻璃纸袋。用无菌水冲洗玻璃纸袋收集子囊孢子到试管中，稀释至每毫升大约100个，吸取200 μL的孢子悬液置于1%水琼脂固体培养基中并均匀涂布后于18 ℃黑暗培养，每2 d观察一次孢子萌发情况。利用光斑实时标记法[5]分离萌发的单孢子转接到牛奶培养基上，置于16 ℃下黑暗培养。

1.2 培养基

本研究采用1%水琼脂培养基(琼脂10 g，加入蒸馏水定容至1000 mL，pH自然)和牛奶培养基(马铃薯200 g，牛奶200 mL，葡萄糖20 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁0.2 g，酵母粉1 g，水解乳蛋白5 g，复合维生素B1一片，琼脂15 g，加入蒸馏水定容至1000 mL，pH自然)，配置的培养基经121℃高压灭菌后备用。

1.3 中国被毛孢三种菌丝的形态观察

每7 d观察1次牛奶培养基上的单孢菌落生长情况，参照文献[8-9]从宏观上对菌落生长速度、菌落颜色、色素分泌、菌丝质地等方面进行形态鉴定并拍照记录。微观上使用光学显微镜和扫描电子显微镜对菌丝粗细、弯曲度、膨大部分、菌丝间关系、菌丝表面特征等方面进行观察分析并拍照记录。

1.4 三种菌丝形态的扫描电镜观察

本研究采用扫描电子显微镜观察菌株TZ8-1的3种常见菌丝形态。分别挑取气生菌丝、菌丝团、基内菌丝于2.5%戊二醛中4℃固定12 h；0.1 mol·L-1的磷酸缓冲液漂洗3次，每次15 min；各体积分数梯度乙醇(30%、50%、70%、90%、95%)脱水1次后用100%乙醇脱水2次，每次20 min；用乙醇和乙酸异戊酯混合液(体积比1∶1)处理30 min；最后用乙酸异戊酯处理2 h后置于冷冻干燥机中处理15 h；干燥后的菌块固定于样品台上进行喷金处理，置于扫描电镜下观察、测量3种形态菌丝的形状和大小并拍照。

2 结果与分析

2.1 三种菌丝的宏观形态特征

本研究发现，菌株TZ8-1在牛奶培养基上生长缓慢。培养60 d时表现为革质状的基内菌丝(图1-A)，呈蚯蚓粪状，质地坚韧，多隆起褶皱，呈现棕黄色，且整个菌落会从中间部位隆起并蔓延，菌落背部凹陷，有少量褐色色素分泌至培养基。培养120 d时，在基内菌丝表面形成若干致密且表面粗糙的绒状白色菌丝团(图1-B)。同一条件下继续培养180 d时白色疏松的气生菌丝(图1-C)开始增多，并逐渐延伸至整个菌落表面。

2.2 三种菌丝的光学显微镜观察

由图2可以看到，中国被毛孢三种不同形态的菌丝存在显著差异。基内菌丝(图2-A)的典型特征为：菌丝隔膜不明显，菌丝较粗，排列紧密，分支多，弯曲度高，菌丝之间多以相互缠绕的方式分布。

菌丝团(图2-B)的典型特征为：菌丝隔膜不明显，隔膜间距和菌丝粗细不均匀，分支多、弯曲度高，菌丝之间交错、重叠现象明显，菌丝杂乱生长，排列无规律性。说明菌丝有扭结的趋势，但外观没有呈现明显的针头状，说明原基的分化还受其他因素的调节或刺激。

气生菌丝(图2-C)的典型特征为：菌丝平直、隔膜明显，菌丝粗细均匀，排列疏松，分支少，次级菌丝多且以并列方式分布，弯曲度低，菌丝之间相互融合、交错、重叠现象不明显，生长较为整齐，具有方向性。同时在菌丝顶端或中部以出芽的方式形成大量的分生孢子(图2-C中箭头1、2所指部分)，多数呈肾形，少数以椭圆形、长椭圆形及近球形等形态存在，形成后掉落或附着在菌丝上，说明气生菌丝是中国被毛孢无性孢子繁殖的主要状态。这一现象暗示着在培养后期，随着营养和水分的消耗，气生菌丝为了争夺营养空间加速生长，进而产生了大量的分生孢子。

综上，3种菌丝的显微形态差异较大。基内菌丝粗且多分支，弯曲度高，排列紧密且相互缠绕。构成菌丝团的菌丝粗细不一，多分支，排列无规律。气生菌丝粗细均匀，少分支且弯曲度低，排列疏松。

2.3 三种菌丝的扫描电镜观察

本研究对3种菌丝的扫描电镜(图3)观察可以确定菌丝的粗细、弯曲度、膨大部分、菌丝间关系、菌丝表面特征等微观特征。对3种形态菌丝的特征描述如表1所示。

A，基内菌丝；B，菌丝团；C，气生菌丝。标尺为5 μm。A，Substrate mycelium；B，Hyphae kont；C，Aerial mycelium. Bar=5 μm.图2 中国被毛孢TZ8-1三种菌丝的光学显微图Fig.2 Optical micrographs of three kind of mycelium of Ophiocordyceps sinensis TZ8-1

图3-A显示基内菌丝排列紧密，图3-B中箭头所指为基内菌丝的“H”型融合，与毛雄明等[10]的观察结果一致。图3-C中箭头所指为部分基内菌丝发生重叠。基内菌丝发生菌丝的“H”型融合和重叠，且菌丝较粗、多分枝，这种生长方式增强了菌丝对环境的适应能力，达到吸收更多营养物质的目的，有利于菌丝网络的形成[11]，为中国被毛孢进一步的生长发育奠定基础。

表1 中国被毛孢TZ8-1三种菌丝的扫描电镜特征

A—C，基内菌丝；D—F，菌丝团；G—I，气生菌丝。标尺：A，D，G为20 μm；B，E，H为10 μm；C，F，I为 5 μm。A-C，Substrate mycelium；D-F，Hypha knot；G-I，Aerial mycelium. Bar: A，D，G=20 μm；B，E，H=10 μm；C，F，I=5 μm.图3 中国被毛孢TZ8-1三种菌丝的扫描电镜图Fig.3 Scanning electron microscopy of three kind of mycelium of Ophiocordyceps sinensis TZ8-1

图3-E中箭头所指部分为菌丝的膨大部分，此现象发生在基内菌丝完成营养生长后出现的菌丝团中，图3-F中箭头所指为菌丝的扭结部分，在其他食用菌相关研究中，刺芹侧耳在给予光照刺激后菌丝发生扭结，形成原基，进而分化成菇蕾[12]。金针菇菌丝体受到机械损伤后通过上调表达疏水蛋白来诱导菌丝的扭结进而形成子实体[13]。

图3-I中1所指为气生菌丝表面所附着的分生孢子，其数量多、分布广。这表明在营养匮乏的后期为争夺营养空间，气生菌丝不断延伸并产生大量的分生孢子加速繁殖。图3-I中2为菌丝发生的褶皱部分，猜测其原因是样品制备过程中脱水或干燥环节操作不当造成的。

3 讨论与结论

关于分生孢子的产生方式。本研究发现分生孢子在菌丝顶端或中部直接以出芽的方式形成，这不同于王灿[14]与何苏琴等[15]的报道，中国被毛孢的分生孢子产生于已分化的分生孢子梗或具有一定形状小梗上。但与肖岩岩等[16]的观察结果一致，即分生孢子可通过在菌丝两侧或顶端产生芽生孢子的方式产生。与前两者不同的原因可能是所用菌种来源于甘南藏族自治州且经组织分离获得，而与后者相同的原因是所用菌种由单个子囊孢子分离而来。因而，菌种的产地来源、分离方法和培养方法都是造成差异的因素。此外，取样时间也可能对分生孢子产生方式的观察有一定的影响，其具体原因有待进一步深入研究。

菌丝团中的菌丝膨大现象可能是作为一个临时储藏营养的场所[17]，蓄积营养为进一步发育成针头状原基做准备。膨大部分是否为扭结出现针头和菌蕾的前期征兆还未可知。因取样时间限制了后期进一步观察菌蕾的形成，故菌丝膨大的原因有待深入研究。

三种菌丝的发生顺序有时间差异，即与培养时间或营养胁迫有关，如香菇菌丝在营养消耗至不适于继续生长时菌丝发生扭结形成菌丝团，最终发育成原基[18]。

本研究发现，菌丝团未能扭结成为针头状原基，推测原因是上述培养基不能满足发育成针头状的营养条件，需要其他因素的协助刺激。其内在机理有待进一步探讨。

综上所述，中国被毛孢在固体培养基上出现的3种菌丝形态与菌株纯度无关，是菌种的特性之一。三种菌丝的显微形态差异明显，气生菌丝是中国被毛孢无性孢子繁殖的主要状态。 且分生孢子的产生方式是芽生。