庄 乐 马伟元



·论著·

miR-203及其下游靶基因p63和survivin在瘢痕疙瘩皮损中的表达

庄 乐 马伟元

目的： 检测瘢痕疙瘩皮损中miR-203及其下游靶基因p63和survivin mRNA的表达。方法： Real-time PCR法检测30例瘢痕疙瘩皮损及30例健康对照皮肤中miR-203、p63和survivin mRNA的表达。结果： 与健康对照皮肤相比，瘢痕疙瘩皮损中miR-203表达明显下调，其表达量为对照组的0.32±0.16倍(P<0.05)，靶基因p63和survivin mRNA表达明显上调，其表达量分别为对照组的3.90±0.84倍和5.11±0.93倍(均P<0.05)。经Pearson相关性分析，miR-203与survivin间呈负相关(r=-0.40，P<0.05)，miR-203与p63间呈负相关(r=-0.51,P<0.05)。结论： miR-203及其下游靶基因p63和survivin可能参与了瘢痕疙瘩的发病过程。

miR-203； p63； survivin； 瘢痕疙瘩

瘢痕疙瘩是人类皮肤受损、创面愈合后局部组织过度纤维化的结果，成纤维细胞的大量增生和胶原的过度沉积是瘢痕疙瘩的组织病理学改变[1]。以往的研究证实，p63和凋亡抑制基因(survivin)在瘢痕疙瘩皮损中高表达[2,3]，且参与成纤维细胞异常增殖和胶原蛋白分泌等病理过程，但其具体的调控机制不清。基因表达受到多个层面和多条途径的调控，目前microRNA调控基因表达和表观遗传学研究成为了热点问题。其中miR-203参与皮肤发育、稳态及功能维持，是皮肤中重要的调控因子[4]。目前研究证实，miR-203为survivin和p63上游重要的调控基因[5,6]。本研究拟通过real-time PCR技术检测瘢痕疙瘩皮损中miR-203、survivin和p63 mRNA的表达情况，统计分析其表达水平的相关性，从mircoRNA角度解释瘢痕疙瘩皮损中p63和survivin基因表达上调的原因。

1 材料和方法

1.1 临床资料 收集2013年1月至2014年7月，我科病理室保存的瘢痕疙瘩患者蜡块标本30例。其中男性15例，女性15例，年龄19～46岁，平均37.6岁。 另选取30例健康皮肤为对照组，两组在年龄、性别、取材部位上相匹配。本研究获医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 材料与试剂 石蜡组织总RNA提取试剂盒、石蜡组织microRNA提取试剂盒购于北京百泰克生物技术公司，一步法反转录试剂盒、SYBR Green I实时定量PCR kit购于瑞士罗氏公司，DEPC及RNase free水购于北京索莱宝生物技术公司，氯仿、异丙醇、无水乙醇等均为分析纯，购于国药集团上海试剂公司。

1.3 实验方法

1.3.1 总RNA和microRNA的提取 将蜡块标本整修去除组织周围尽量多的石蜡，10 μM厚连续切片，取4张切片装入一个无RNase的Ep管中，二甲苯脱蜡，无水乙醇彻底洗涤并晾干,后续提取步骤严格按照microRNA和总RNA提取试剂盒的说明书进行。微量紫外分光光度计测定总RNA的纯度和浓度。

1.3.2 Real-time PCR检测miR-203、survivin及p63的表达 MA Weiyuan采用一步法反转录试剂盒合成cDNA，microRNA的反转录采用加尾法。SYBR green I染料法进行Real-time PCR反应，miR-203以U6作为内参照，引物购自广州复能基因有限公司，survivin和p63以GAPDH作为内参照。survivin、p63及GAPDH引物均由 Primer Premier 6.0 软件设计，BLAST验证引物特异性，上海生工生物工程技术服务有限公司合成，具体引物序列为：survivin上游5ˊ-GACCACCGCATCTCTACATTC-3ˊ，下游5ˊ-TGCTTTTTATGTTCCTCTATGGG-3ˊ，p63上游5ˊ-GAAACCAGAGATGGGCAAGTC-3ˊ下游5ˊ-GCTTCGTACCATCACCGTTCT-3ˊ，GAPDH上游5ˊ-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3ˊ，下游5ˊ-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3ˊ。每个样本设3个复孔，反应条件为：95℃预热3 min；95℃12 s，60℃ 40 s，40个循环。△Ct值=目的基因的Ct值-同组内参的Ct值，△△Ct=△Ct实验组-△Ct对照组，2-△△Ct值即为实验组目的基因较对照组目的基因表达的倍数。

2 结果

2.1 miR-203、survivin、p63在瘢痕疙瘩皮损中的表达 采用real-time PCR技术检测30例瘢痕疙瘩皮损与30例健康对照皮肤组织中miR-203、survivin、p63的表达水平。通过荧光定量 PCR 扩增曲线，产物到达平台期，对融解曲线分析，可以看到单一的峰型，说明扩增产物有较高的特异性。PCR 产物采用比较Ct法定量，根据 2- △△Ct值计算基因的起始模板量，从而反映出在不同样本的表达水平。结果发现，瘢痕疙瘩皮损中miR-203的表达较健康对照皮肤明显下调，其表达量为对照组的0.32±0.16倍(t=22.73，P<0.05)，survivin和p63在瘢痕疙瘩皮损中的表达较健康对照皮肤明显上调，其表达量分别为对照组的5.11±0.93倍(t=24.87，P<0.05)，3.90±0.84倍(t=17.11，P<0.05)。结果如图1～3所示。

图1 Real-time PCR法检测瘢痕疙瘩皮损与健康对照组皮肤组织中miR-203 mRNA的相对表达量，瘢痕疙瘩皮损中miR-203的表达显著下调(*P<0.05) 图2 Real-time PCR法检测瘢痕疙瘩皮损与健康对照组皮肤组织中survivin mRNA的相对表达量，瘢痕疙瘩皮损中survivin的表达显著上调(*P<0.05) 图3 Real-time PCR法检测瘢痕疙瘩皮损与健康对照组皮肤组织中p63 mRNA的相对表达量，瘢痕疙瘩皮损中p63的表达显著上调(*P<0.05)

2.2 瘢痕疙瘩皮损中miR-203与sruvivin、p63表达的相关性经Pearson相关性分析，miR-203与survivin两者之间呈负相关(r=-0.40，P<0.05)，miR-203与p63两者之间呈负相关(r=-0.51,P<0.05)。

3 讨论

成纤维细胞在瘢痕疙瘩的形成、发展和转归过程中处于中心地位，而成纤维细胞中胶原蛋白合成异常导致的细胞外基质代谢异常是瘢痕疙瘩发病的重要因素[7，8]。国内外研究发现，瘢痕疙瘩成纤维细胞与正常真皮成纤维细胞在形态学上并没有明显差异，但在功能上却明显不同。与正常成纤维细胞相比，瘢痕疙瘩成纤维细胞合成胶原蛋白的能力明显提高[9]。成纤维细胞增殖、凋亡及分化的异常，是多个层面、多条途径、多种方式调控异常导致的病理表现。目前研究普遍认为，瘢痕疙瘩中存在过度表达的细胞转化生长因子β(TGF-β)，过度表达的TGF-β通过各种信号转导通路最终导致了胶原蛋白的过度合成和分泌。除合成过度外，瘢痕疙瘩组织中还存在胶原蛋白降解的异常，最终致使胶原蛋白合成大于分解，过度的胶原蛋白沉积引发了瘢痕疙瘩皮损的形成[9]。miR-203是一种具有高度皮肤特异性的microRNA，在皮肤发育中起着调控细胞增殖和分化的开关作用[4]。miR-203 在增殖细胞中高表达，能够抑制细胞增殖、诱导并促进细胞分化[10]。本研究结果证实，瘢痕疙瘩皮损中miR-203表达水平较健康对照皮肤明显下调。由此推测，低表达的miR-203可能参与瘢痕疙瘩成纤维细胞异常增殖和胶原蛋白过度分泌的病理过程。

目前生物信息学研究证明，survivin和p63都是miR-203进化保守的靶基因之一。survivin主要在细胞周期G2/M期表达,定位于细胞有丝分裂的纺锤体,具有促进细胞有丝分裂的作用。此外，survivin还可以直接抑制Caspase-3和Caspase-7蛋白的表达，抑制细胞凋亡[11]。本研究发现瘢痕疙瘩皮损中survivin mRNA的表达水平较健康对照皮肤组织明显上调，这与国内外的研究结果均一致[2]。survivin作为凋亡抑制蛋白(IAP)家族的重要成员[12]，是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子之一，和瘢痕疙瘩的形成有密切关系。survivin的高表达与瘢痕疙瘩成纤维细胞的异常增殖和分化有关，同时也参与瘢痕组织中毛细血管的新生过程[13]。p63基因是肿瘤抑制基因p53家族成员之一，其在细胞死亡、分化、肿瘤发生中扮演重要角色[14]，控制着成纤维细胞的增殖和分化。本研究结果发现，p63 mRNA在瘢痕疙瘩皮损中表达上调，这与国外的研究结果一致[3]。高表达的p63基因能够通过特异性的结合到启动子区域，阻断肿瘤抑制基因p53的功能[15，16]，从而在瘢痕疙瘩中发挥重要作用。经统计分析，miR-203 mRNA的表达水平与survivin mRNA的表达水平呈负相关，与p63 mRNA的表达水平呈负相关。由此推测，miR-203的异常表达可能导致survivin和p63基因表达上调，进而促进瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、抑制其凋亡，参与了皮损的形成过程。

综上所述，miR-203可能通过调控其下游靶基因survivin、p63的异常表达参与瘢痕疙瘩皮损的形成过程。

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(收稿：2017-01-10 修回：2017-02-22)

Expression of miR-203 and its downstream targets p63 and survivin in the keloid lesions

ZHUANGLe,MAWeiyuan.

Departmentofdermatology,QiluHospitalofShandongUniversity,Jinan250012,China.

Correspondingauthor:MAWeiyuan,E-mail:dermatologyqlh@163.com

Objective: To detect the RNA expression levels of miR-203 and its downstream targets p63 and survivin in the lesions of keloid. Methods: The RNA levels of miR-203 and its downstream targets p63 and survivin from 30 lesions and 30 normal controls were detected by the quantitative real-time PCR technique. Results: The expression level of miR-203 in the lesions of keloid was dramatically down-regulated which was 0.32±0.16 of the normal controls (P<0.05). While the expression levels of p63 and survivin in the lesions of keloid were sharply up-regulated which were 3.90±0.84 times and 5.11±0.93 times than those in the normal controls respectively (P<0.05). Conclusion: miR-203 and its downstream targets p63 and survivin are probably involved in the pathogenesis of keloid.

miR-203; p63; survivin; keloid

山东省自然科学基金资助(编号：ZR2014MP007)

山东大学齐鲁医院皮肤科，济南，250012

马伟元，E-mail：dermatologyqlh@163.com