朱峰　宋照风　王春燕

摘要：【目的】分析脱皮大环柄菇化学成分并评价其抗氧化活性，为脱皮大环柄菇的综合利用提供科学依据。【方法】联合运用丙酮提取和真空旋转水蒸气蒸馏法从脱皮大环柄菇新鲜子实体中获得脱皮大环柄菇挥发油和丙酮粗提物，采用气相色谱—质谱联用技术（GC-MS）分析脱皮大环柄菇挥发油化学成分，运用试管预试法检测丙酮粗提物的化学成分，通过自由基清除试验评价其抗氧化活性。【结果】GC-MS分析结果表明，脱皮大环柄菇挥发油主要化学成分为酮类化合物，其中4-甲基-4-羟基戊酮相对含量高达86.32%。试管预试法检测结果显示，脱皮大环柄菇丙酮粗提物含有生物碱、甾醇和萜类成分。自由基清除试验结果表明，脱皮大环柄菇丙酮粗提物具有有效的抗氧化活性，其清除羟自由基（·OH）和DPPH自由基的半数清除浓度（EC50）分别为260.45和552.87 μg/mL。【结论】脱皮大环柄菇挥发油化学成分独特，含7种酮类化合物、1种醇类化合物和1种酯类化合物，丙酮粗提物因含有生物碱、甾醇和萜类等活性成分且具有有效的抗氧化活性，值得进一步研究开发。

关键词： 脱皮大环柄菇；挥发油；化学成分；抗氧化活性；气相色谱—质谱联用技术

中图分类号： S646.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）02-0297-05

Abstract：【Objective】The chemical compositions of Macrolepiota detersa were analyzed and its antioxidant activity was evaluated to provide theoretical references for its development and utilization. 【Method】Volatile oil and acetone crude extract were obtained from fresh fruit bodies of M. detersa by acetone extraction and vacuum rotatory steam distillation. Chemical compositions of the volatile oil were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS） method，and chemical constituents of acetone crude extract were analyzed by pre-test tube method. Antioxidant activity of acetone crude extract was evaluated by free radical scavenging experiment. 【Result】GC-MS results showed the main components in the volatile oil were ketone compounds， and the main component 4-hydroxy-4-methyl-2-pentanone accounted for 86.32%. Acetone crude extract contained alkaloids，sterols，and terpenes according to pre-test tube method. Free radical scavenging experiment indicated that acetone crude extract contained antioxidant activity， and half maximal effective concentration（EC50） values of·OH radical scavenging activity was 260.45 μg/mL while EC50 values of·DPPH radical scavenging activity was 552.87 μg/mL. 【Conclusion】The main components in volatile oil of M. detersa include seven ketone compounds， one alcohol compound and one ester compound. Acetone crude extract contains alkaloids， sterols， and terpenes， thus embodies antioxidant activity. Therefore M. detersa is worth further development.

Key words： Macrolepiota detersa； volatile oil； chemical composition； antioxidant activity； gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）

0 引言

【研究意義】大环柄菇（Macrolepiota detersa）属于大环柄菇属（Macrolepiota sp.）真菌，有30余种，多数为可食用菌类（冯飞等，2009），其中分布于我国的有6种，脱皮大环柄菇（M. detersa Z. W. Ge，Zhu. L. Yang & Vellinga sp. nov.）是新记录种（Ge et al.，2010），还未得到有效开发利用。因此，研究脱皮大环柄菇化学成分及其抗氧化活性，对该菌的综合利用具有重要意义。【前人研究进展】Dulger等（2008）对3种土耳其大环柄菇（M. heimii、M. rachodes和M. puellaris）子实体乙醇提取物进行抗微生物试验，结果表明，M. heimii对微球菌（Micrococcus sp.）和弗氏枸橼酸杆菌（Citrobacter freundii）表现出有效的抗菌活性，但抗酵母菌活性较弱。Sabotic等（2009）从M. procera中鉴定了一组新的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，命名为Macrocypins。Han（2010）证实了M. procera具有有效的酪氨酸酶抑制活性。高大环柄菇（M. procera）甲醇提取物的抗氧化能力较强，但未显示有效的抗微生物活性，其强抗氧化能力与其酚性物质含量较高有关（Barros et al.，2009；Qzen et al.，2011；Witkowska et al.，2011）。Sa-

manta等（2013，2015）从长柄大环柄菇（M. Dolichaula）分离获得两个具有抗氧化和免疫活性的糖（PS-I和PS-II），并对其结构进行鉴定。继Ohta等（1998）从新乳头状大环柄菇（M. neomastoidea）中发现新生物碱Lepiotins A和Lepiotins B后，Kim等（2008， 2009a， 2009b）又从M. neomastoidea中发现了系列新生物碱，如Neomastoidin A和Macrolepiotin。【本研究切入点】迄今，未见有关脱皮大环柄菇（M. detersa）生物活性和化学成分研究的报道。【拟解决的关键问题】通过气相色谱—质谱联用技术（GC-MS）分析脱皮大环柄菇挥发油化学成分，采用试管预试法检测其丙酮粗提物化学成分，运用自由基清除试验评价其丙酮粗提物的抗氧化活性，为脱皮大环柄菇的综合利用提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

材料：野生脱皮大环柄菇于2014年8月采自江西省九江市星子县秀峰黄岩景区神仙洞附近竹林地，葛再伟鉴定为M. detersa Z. W. Ge，Zhu. L. Yang & Vellinga sp. nov.（Ge et al.，2010）；1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）购自Sigma公司；丙酮（深圳市王牌化工有限公司）、乙醚（广州钱盛化工有限公司）、抗坏血酸（广东光华科技股份有限公司）、双氧水（天津市百世化工有限公司）、硫酸亚铁（北京康普汇维科技有限公司）、水杨酸（天津市津北精细化工有限公司）、95%乙醇（天津市永大化学试剂有限公司）、无水硫酸镁（天津博迪化工股份有限公司）和甲醇（东莞市乔科化学有限公司）均为市售分析纯试剂。

仪器：RV8型旋转蒸发仪（德国IKA），UV-2501PC型紫外—可见吸收光谱仪（日本岛津），安捷伦7890A气相色谱—安捷伦5975C质谱联用仪（美国安捷伦）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 脱皮大环柄菇挥发油提取及化学成分分析 采用真空旋转蒸馏法提取脱皮大环柄菇挥发油。3株新鲜脱皮大环柄菇共180 g，用1000 mL丙酮充分浸泡提取3次，丙酮提取液合并常压蒸馏回收丙酮后，残液在95 ℃水浴加热下通过真空旋转蒸馏得残渣为丙酮粗提物，馏出液用等体积乙醚萃取3次，乙醚萃取液合并，用无水MgSO4干燥后回收乙醚得脱皮大环柄菇挥发油。挥发油化学成分采用GC-MS进行分析。色谱条件：色谱柱采用J&W 122-0132DB-1ms石英毛细管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；程序升温（起始温度60 ℃，恒温5 min，先以2 ℃/min升温至100 ℃，然后以2 ℃/

min升温至200 ℃，再以25 ℃/min升温至300 ℃，恒温5 min）；进样口温度250 ℃，进样量1 μL；分流比16∶1；载气为氦气。质谱条件：EI离子源，离子源温度220 ℃，电子能量70 ev，扫描范围10～550 m/z。定性定量方法：各组分峰相对含量的确定采用峰面积归一法。获取的质谱数据使用美国NIST08.L谱库进行分析。

1. 2. 2 脱皮大环柄菇丙酮粗提物化学成分预分析

取1.2.1中丙酮粗提物，用甲醇溶解并配制成质量浓度为5 mg/mL的样品溶液。采用试管预试法（张智锦等，2011）检测丙酮粗提物化学成分，即取1 mL样品溶液加入试管内，加检测试剂后1～2 d，水浴加热，观察反应现象。采用三氯化铁试剂检测酚性成分，采用Dragendorff试剂检测生物碱成分，采用盐酸—锌粉试验检测黄酮类成分，采用Borntr■ger反应和醋酸镁试验检测蒽醌类成分，采用Kedde试剂检测强心甙，采用Liebermann-Burchard反应和Salkowski反應检测甾醇和三萜成分。

1. 2. 3 脱皮大环柄菇丙酮粗提物清除羟自由基（·OH）活性试验 采用水杨酸-FeSO4-H2O2体系，参照卢卫红等（2014）和岑婉莹等（2016）的方法，运用分光光度法测定不同浓度样品溶液体外清除·OH的能力。分别精密移取样品溶液0～2.0 mL加入干净的具塞试管中，加甲醇补足至5 mL，然后加入6 mmol/L水杨酸乙醇溶液1 mL，摇匀后加入2 mmol/L硫酸亚铁水溶液1 mL，再加入1.5%双氧水溶液1 mL，以蒸馏水代替1.5%双氧水溶液为空白对照，摇匀，用甲醇定容至10 mL，置于37 ℃水浴恒温反应60 min。于510 nm处测吸光度。计算·OH清除活性（%RSA）。3次重复。以%RSA对样品浓度作图，从图中计算出%RSA为50%时的样品浓度，即为·OH半数清除浓度（EC50）。以标准抗氧化剂抗坏血酸为阳性对照。

1. 2. 4 脱皮大环柄菇丙酮粗提物清除DPPH自由基活性试验 参照Seephonkai等（2011）的方法，采用分光光度法测定不同浓度样品溶液体外清除DPPH自由基的能力。分别精密移取样品溶液0～1.0 mL加入干净的具塞试管中，加甲醇补足至1 mL，然后各加入0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL，摇匀，避光反应30 min，以甲醇为空白对照，于517 nm处测吸光度。计算DPPH自由基清除活性（%RSA）。3次重复。以%RSA对样品浓度作图，从图中计算出%RSA为50%时的样品浓度，即为DPPH自由基半数清除浓度（EC50）。以标准抗氧化剂抗坏血酸为阳性对照。

2 结果与分析

2. 1 脱皮大环柄菇挥发油化学成分分析结果

从新鲜脱皮大环柄菇中提取的挥发油为棕黄色具芳香气味的液体。用GC-MS分析挥发油化学成分得到总离子流色谱图（图1）。通过NIST08.L谱库检索，共检出9种化学成分（表1），占总油量的94.84%，主要为酮类化合物（7种），其中相对含量较高的3种酮类化合物依次为4-甲基-4-羟基-2-戊酮（86.32%）、2，3-二甲基-2-环戊烯-1-酮（4.37%）和4-甲基-3-戊烯-2-酮（3.56%）；醇类化合物2-环己烯-1-醇含量为0.12%；酯类化合物邻苯二甲酸二丁酯含量为0.07%。

2. 2 脱皮大环柄菇丙酮粗提物化学成分预分析结果

试管预试验结果表明，脱皮大环柄菇丙酮粗提物遇三氯化铁不显色，说明脱皮大环柄菇丙酮粗提物不含酚性成分；遇Dragendorff试剂产生红棕色沉淀，说明脱皮大环柄菇丙酮粗提物含生物碱成分；在盐酸—锌粉试验中未呈红色反应，说明脱皮大环柄菇丙酮粗提物不含黄酮类成分；在Borntr■ger反应中遇氢氧化钠产生大量气体，并有大量白色沉淀产生，但未产生红色反应，结合醋酸镁试验中也未出现红色反应，判断脱皮大环柄菇丙酮粗提物不含蒽醌类成分；遇Kedde试剂未产生红色或紫色反应，说明脱皮大环柄菇丙酮粗提物不含强心甙；在Liebermann-Burchard反应中出现一系列颜色变化，说明脱皮大环柄菇丙酮粗提物含有甾醇和萜类成分；同时在Salkowski反应中发生颜色反应，进一步证明脱皮大环柄菇丙酮粗提物含有甾醇。

2. 3 脱皮大环柄菇的抗氧化活性

脱皮大环柄菇丙酮粗提物·OH和DPPH自由基活性清除结果分别见图2和图3。由图2和图3计算得到脱皮大环柄菇丙酮粗提物和抗坏血酸对·OH的EC50分别为260.45和103.34 μg/mL，对DPPH自由基的EC50分别为552.87和66.01 μg/mL。

3 讨论

高等真菌挥发油化学成分丰富多样，并具有多种多样的生物活性。岑婉莹等（2016）从红贝俄氏孔菌精油分离鉴定出35种物质，并发现红贝俄氏孔菌精油具有较强的抗氧化活性。目前，关于大环柄菇属真菌化学成分和生物活性的研究鲜见报道。王凯和杨晋（2010）研究显示，老瓜头挥发油中的4-甲基-4-羟基-2-戊酮含量高达43.70%。杨平荣等（2015）研究发现，异叶青兰挥发油中含有4-甲基-4-羟基-2-戊酮；本研究通过GC-MS从脱皮大环柄菇挥发油中分离鉴定出9种成分，其中7种为酮类化合物，1种为醇类化合物，1种为羧酸酯，其中的4-甲基-4-羟基-2-戊酮相对含量最高，达86.32%。本研究在脱皮大环柄菇挥发油中发现了高含量（4.37%）的2，3-二甲基-2-环戊烯-1-酮，该成分是竹醋液化学成分的特征性组成成分（钱华等，2007），可能与脱皮大环柄菇生长于竹林地有关。该化合物有可能是脱皮大环柄菇化学分类学的标志性化学成分。

食用菌的抗氧化活性与总酚含量呈正相关，食用菌提取物中的其他抗氧化物对其抗氧化活性也有很大贡献（Seephonkai et al.，2011）。本研究中自由基清除试验结果显示，脱皮大环柄菇丙酮粗提物具有有效的抗氧化活性，其抗氧化能力随着样品浓度的增加而增强，与李奕星等（2015）的研究结果相似；当体系中样品浓度为0.50 mg/mL时，其·OH活性的清除率为91.26%，与标准抗氧化剂抗坏血酸的97.83%接近；当体系中样品浓度为1.33 mg/mL时，其DPPH自由基活性的清除率达94.37%，与抗坏血酸的96.70%接近。对脱皮大环柄菇丙酮粗提物化学成分的预分析结果表明，该粗提物含有生物碱、甾醇和萜类成分，但不含酚性和黄酮等成分，说明脱皮大环柄菇抗氧化活性主要来源于生物碱、甾醇和萜类成分。由于在与脱皮大环柄菇同属的真菌M. neomastoidea中发现有丰富的生物碱，如内酰胺类生物碱（Ohta et al.，1998；Kim et al.，2008，2009a，2009b），而脱皮大环柄菇丙酮粗提物遇氢氧化钠产生气泡和生成沉淀，表明脱皮大环柄菇也可能含有内酰胺类生物碱，并与氢氧化钠反应生成氨气和羧酸钠，但尚需采集足够材料进一步通过分离纯化进行鉴定。

4 结论

脱皮大环柄菇挥发油化学成分独特，含7种酮类化合物、1种醇类化合物和1种酯类化合物，丙酮粗提物因含有生物碱、甾醇和萜类等活性成分且具有有效的抗氧化活性，值得进一步研究开发。

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（責任编辑 思利华）