曲俊杰　黄羽　卢江　尹玲

摘要：【目的】明确葡萄霜霉病抗性蛋白（MrRPV1）LRR结构域对葡萄霜霉菌特异性识别的影响，为进一步研究葡萄与霜霉菌间的互作机理打下基础。【方法】将MrRPV1和白粉病抗性蛋白（MrRUN1）两个蛋白的LRR结构域互换，构建重组表达载体后转化至感霜霉病和白粉病的欧亚种西拉葡萄胚性愈伤组织中以获得转基因植株，并通过DNA、RNA分子水平检测和室内接种试验进行抗病性鉴定。【结果】共获得7个RGA10-8LRR阳性转基因（重组了MrRPV1蛋白LRR结构域）株系和6个RGA8-10LRR阳性转基因（重组了MrRUN蛋白LRR结构域）株系。在7个RGA10-8LRR阳性转基因株系中，仅RGA10-8-13阳性植株表现出与MrRPV1转基因苗S8-1一致的坏死斑点，肉眼观察不到白色霜霉状物，但7个阳性转基因系均未表现出明显的白粉病抗性。在6个RGA8-10LRR阳性转基因株系中，RGA8-10-3和RGA8-10-28两个株系表现出对白粉病的抗性，有35%左右的细胞表现出细胞程序性坏死（PCD）；RGA8-10LRR转基因苗均不抗霜霉病。【结论】MrRPV1的LRR结构域可能介导对葡萄霜霉菌的特异性识别，而MrRUN1的LRR结构域可能介导对白粉病菌的特异性识别。

关键词： 葡萄；霜霉病抗性蛋白（MrRPV1）；白粉病抗性蛋白（MrRUN1）；LRR结构域；抗病性

中图分类号： S663.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）02-0202-09

Abstract：【Objective】The function of LRR domain of grape downy mildew resistance protein（MrRPV1） in downy mildew pathogen specific recognition was investigated in order to provide basis for studying the interaction mechanism between grape and downy mildew pathogen. 【Method】The LRR domains of MrRPV1 and powdery mildew resistance protein（MrRUN1） were switched and recombinant expression plasmids were constructed in this study. The recombinant expression plasmids were transformed into embryonic callus of Shiraz grape which was susceptible to downy mildew and powdery mildew so as to obtain transgenic plants. Disease resistance of the transgenic plants was identified by DNA and RNA molecular level detection and indoor inoculation test. 【Result】In total， seven RGA10-8LRR（recombination of LRR domains of MrRPV1） and six RGA8-10LRR（recombination of LRR domains of MrRUN1） positive transgenic lines were obtained. Among the seven RGA10-8LRR transgenic lines， only RGA10-8-13 line exhibited similar necrotic spots to MrRPV1 transgenic plant S8-1 with no visible downy mildew. Furthermore， all the seven RGA10-8LRR transgenic lines showed no significant powdery mildew resistance. Powdery mildew resistance was observed in two RGA8-10LRR transgenic lines， namely RGA8-10-3 and RGA8-10-28， with programmed cell necrosis（PCD） in 35% cells. All the six RGA8-10LRR transgenic lines showed no downy mildew resistance. 【Conclusion】LRR domain of MrRPV1 may play a role in specific recognition of grape downy mildew pathogen and LRR domain of MrRUN1 may play a role in specific recognition of powdery mildew pathogen.

Key words： grape； downy mildew resistance protein（MrRPV1）； powdery mildew resistance protein（MrRUN1）； LRR domain； disease resistance

0 引言

【研究意义】葡萄霜霉病是葡萄生产上的常见病害之一，严重制约了葡萄与葡萄酒产业的可持续发展（王壮伟等，2015）。圆叶葡萄起源于美国东南部，具有优良的抗病性和抗虫性，对霜霉病、皮尔斯病、根瘤蚜等病虫害高抗甚至免疫，目前已通过图位克隆从圆叶葡萄中克隆获得霜霉病抗性基因MrRPV1（Feechan et al.，2013），但有关其介导霜霉病抗性的具体机制尚不清楚。因此，明确MrRPV1蛋白各结构域的功能，可为揭示霜霉病的抗性机理提供理论依据。【前人研究进展】富含亮氨酸的重复序列（Leucine-rich repeat，LRR）是植物抗病蛋白一個非常重要的结构域，该结构域在抗病蛋白识别病原菌效应因子和蛋白—蛋白相互作用中发挥重要作用（Qi and Innes，2013）。Jia等（2000）研究表明，水稻Pi-ta蛋白单独的LRR结构域就能与对应的无毒蛋白Avr-Pita互作，与抗病品种相比，感病品种的Pi-ta基因在LRR结构域末端存在918A→S突变，且体内免疫共沉淀试验也检测到Avr-Pita与全长Pi-ta蛋白间的结合，为佐证LRR结构域与病原菌效应蛋白结合提供了证据支持。Tao等（2000）对拟南芥RPS2、RPM1及Dinesh-Kumar等（2000）对烟草N基因的研究表明，LRR结构域中单个氨基酸的改变就会导致抗病性丧失。Ellis等（2007）对亚麻锈病抗性蛋白的研究结果表明，LRR结构域是病原菌特异识别的主要决定因素。LRR结构域具有调节信号传导的功能。如拟南芥RPS2、RPS5和RPP1A的LRR结构域缺失后，防御反应一直处于激活状态（Tao et al.，2000；Michael Weaver et al.，2006）；过表达马铃薯Rx基因LRR结构域的截短蛋白可使超敏反应加强（Inohara et al.，2005），说明LRR结构域具有负调节抗性信号传导的作用。此外，有研究表明LRR结构域中至少有2个区域对结合NBS区域实现抑制信号传导发挥作用（Rairdan and Moffett，2006）。【本研究切入点】葡萄霜霉病抗性蛋白MrRPV1和白粉病抗性蛋白MrRUN1均属于典型的TIR-NBS-LRR类型，二者在染色体的同一个位点上，且氨基酸水平具有86%的相似性，主要差别在于羧基端LRR的重复数不同（Feechan et al.，2013）。其中，MrRPV1含有20个LRR重复，MrRUN1含有16个LRR重复，但二者较高的序列同源性和功能差异是否能通过结构域交换确定其对病原菌的特异识别尚需进一步验证。【拟解决的关键问题】利用结构域互换技术对MrRPV1蛋白LRR结构域的功能进行研究，旨在明确LRR结构域对葡萄霜霉菌特异性识别的影响，为进一步研究葡萄与霜霉菌间的互作机理打下基础。

1 材料与方法

1. 1 植物材料、载体及菌株

西拉葡萄胚性愈伤组织（以花药经组织培养诱导获得）由澳大利亚联邦科学与工业组织Ian Dry博士实验室保存提供；霜霉菌为田间采集的混合菌；MrRPV1转基因苗S8-1和MrRUN1转基因苗S10-11参照Feechan等（2013）的研究方法制备，受体材料均为西拉葡萄；携带pCLB2301-RGA8_RGA10_SK（#1310）和pCLB2301-RGA10_RGA8_SK（#1311）质粒的农杆菌菌株EHA105也由Ian Dry博士实验室保存提供，该载体中RGA8即为MrRPV1、RGA10即为MrRUN1。

1. 2 农杆菌介导的葡萄胚性愈伤组织遗传转化

农杆菌介导葡萄胚性愈伤组织遗传转化过程所需的培养基均参考Bouquet等（2006）的方法配制，其他操作步骤如下：

1. 2. 1 菌液活化 将含有目的质粒的农杆菌菌株接种在含利福平（25 μg/mL）、卡那霉素（100 μg/mL）的MG/L培养基上，28 ℃培养2 d，进行菌株活化以获得单菌落。挑取单菌落接种于含抗生素的MG/L培养基中（3.0 mL），28 ℃下摇床（220 r/min）培养过夜。取10 μL过夜培养物接种于含卡那霉素的MG/L培养基中（25.0 mL），28 ℃下摇床（220 r/min）培养过夜，进行扩大培养。测定上述培养物的OD600，待OD600达0.8～1.0时，5000 r/min离心8 min，收集菌体，用25.0 mL LCM培养基重悬，28 ℃摇床（220 r/min）培养3 h。

1. 2. 2 农杆菌侵染 从GS1CA培养基中收集胚性愈伤组织置于新的培养皿中，吸掉多余水分。将3.0 mL农杆菌菌液滴于胚性愈伤组织上进行侵染，10 min后用无菌滤纸吸掉多余菌液。

1. 2. 3 共培养 将侵染后的愈伤组织均匀铺在新的培养皿中，培养皿预先铺好用GS1CA液体培养基完全浸湿的3层滤纸，封口膜封好培养皿，22 ℃暗培养48 h。收集并用含1000 μg/mL特美汀的LCM液体培养基洗涤胚性愈伤组织，筛网过滤收集愈伤组织，转移至含1000 μg/mL特美汀的GS1CA培养基上，28 ℃暗培养9～10 d。

1. 2. 4 继代培养 将胚性愈伤组织转移至含1000 μg/mL特美汀和100 μg/mL卡那霉素的GS1CA培養基上，28 ℃继续暗培养。

1. 2. 5 筛选培养 4周后将继代培养后的愈伤组织转移至含1000 μg/mL特美汀和100 μg/mL卡那霉素的NN筛选培养基上，28 ℃继续暗培养。每隔3～4周继代一次，直至萌发出子叶型胚状体。

1. 2. 6 阳性胚状体筛选 将开始萌发的子叶型胚状体放置在荧光体视显微镜下观察GFP荧光，筛选出阳性胚状体。

1. 2. 7 阳性胚状体培养 将具有GFP荧光的萌发阳性子叶型胚状体转移至含2 mol/L 6-苄基腺嘌呤（BAP）的1/2MS培养基上光照培养，继续萌发至真叶产生；然后转移至不含激素的1/2MS培养基上继续培养。

1. 2. 8 生根培养 将生长至一定程度的小植株转移至生根培养基上进行生根培养，待根部萌发生根后转移至土壤中，置于温室中培养。

1. 3 转基因阳性苗鉴定

1. 3. 1 报告基因GFP荧光观察 向土壤中转移植株前在荧光体视显微镜下观察叶片和根部的GFP荧光，能观察到GFP荧光的植株初步确定为阳性苗，用于下一步鉴定。

1. 3. 2 DNA水平鉴定 采用CTAB法提取GFP阳性植株叶片的基因组DNA（Zhang et al.，1998），再以MrRPV1和MrRUN1基因各自的特异引物（表1）检测转基因植株中的基因重组情况。重组了MrRPV1蛋白LRR结构域的植株命名为RGA10-8LRR植株，重组了MrRUN1蛋白LRR结构域的植株命名为RGA8-10LRR植株。RGA10-8LRR阳性植株DNA水平鉴定选用3对特异引物，其中，RGA10部分采用MrRUN1基因的特异引物对AJ87/AJ88扩增RGA10前段，扩增产物为504 bp，同时设4个对照，pCLB2301-RGA10_RGA8_SK（#1311）质粒为阳性对照，RGA8-10LRR转基因植株RGA8-10-1a叶片、未转基因的西拉葡萄叶片和水为阴性对照；重组LRR部分采用MrRPV1基因的特异引物对CB600/CB632和CB627F/CB622R分别扩增其前段和后段，扩增产物分别为200和337 bp。RGA8-10LRR阳性植株DNA水平鉴定选用4对特异引物，其中，RGA8部分采用MrRPV1基因的特异引物对CB578/CB581扩增RGA8前段，引物对CB438/CB437扩增RGA8前后段，扩增产物分别为150和400 bp，同时设4个对照，pCLB2301-RGA8_RGA10_SK（#1310）质粒为阳性对照，RGA10-8LRR转基因植株RGA10-8-3叶片、未转基因的西拉葡萄叶片和水为阴性对照；重组LRR部分则采用MrRUN1基因的特异引物对CB564/CB181和CB629F/CB630R分别扩增其前段和后段。

1. 3. 3 RNA水平鉴定 使用Spectrum Plant Total RNA Kit提取GFP阳性植株叶片RNA，NanoDrop ND-1000分光光度计测定提取RNA的纯度和浓度。使用SuperScript VILOTM cDNA Synthesis Kit对RNA进行反转录，获得cDNA，再以MrRPV1和MrRUN1基因各自的特异引物进行重组基因表达情况PCR检测。RGA10-8LRR阳性植株RNA水平鉴定选用2对引物，RGA10部分采用引物对CB20/CB632，RGA8LRR部分采用引物对CB631/CB568，其中CB568是MrRPV1的特异引物。RGA8-10LRR阳性植株RNA水平鉴定也选用2对引物，RGA8部分采用引物对CB20/CB632，RGA10LRR部分采用引物对CB631/CB556，其中CB556是MrRUN1的特异引物。

1. 4 霜霉病和白粉病抗性鉴定

葡萄霜霉病抗性鉴定采用叶盘接种法，具体操作方法：选取完全伸展开的葡萄叶片，以去离子水清洗后晾干备用；用打孔器将叶片打成直径1 cm的叶盘（避开主叶脉和较大侧叶脉），叶背面朝上放置在铺有湿润无菌滤纸的培养皿中；每个叶盘上滴加35 μL霜霉菌孢子囊悬液（5×104孢子囊/mL），以MrRPV1转基因苗S8-1及其受体材料感病欧亚种西拉葡萄分别为抗、感霜霉病对照，同时以无菌水接种RGA10-8LRR为阴性对照；叶盘在光照培养箱（温度22 ℃，光周期16 h光照/8 h黑暗）中培养24 h后吸取多余的水分和菌液，接种4～5 d后观察发病情况。霜霉菌孢子数统计：每个试验组和对照组的叶盘均用等体积无菌水洗脱，吸取10 μL洗脱后的孢子悬液，小心滴加到血球计数板上进行计数。重复3次。采用 t 检验进行差异显著性分析。

葡萄白粉病抗性鉴定采用离体叶片接种法，具体操作方法：采集温室盆栽的转基因苗幼嫩叶片，按照Feechan等（2011）的方法接种葡萄白粉病菌菌株，48 h后对接种叶片进行台盼蓝染色，观察附着胞、吸器、菌丝及细胞程序性坏死（Programmed cell death，PCD）的产生情况，对抗性进行评估。将观察到吸器和延伸次生菌丝（Elongating secondary hyphae，ESH）结构的细胞定义为被病菌成功入侵（Penetration，PEN）细胞。以每次成功入侵引起的PCD为抗性标志，计算PCD出现频率。PCD出现频率越高，抗性越强，反之则抗性越弱。

1. 5 统计分析

采用Students t-test进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 阳性转基因植株的获得及鉴定结果

采用农杆菌介导的遗传转化方法转化西拉葡萄胚性愈伤组织，约历时一年才获得转基因植株（图1），转移至温室培养。筛选培养基上萌发的西拉葡萄体细胞胚在荧光体视显微镜下观察，其子叶、胚轴、胚根均能观察到GFP荧光，将GFP阳性萌发体细胞胚转移至含2 μmol/L BAP的1/2MS培养基上光照培养，直至长出至少1片真叶，再转移至1/2MS培养基上继续培养，无菌条件下采集一小片转基因植株叶片，制成切片，在共聚焦显微镜下观察叶片GFP荧光。将获得的GFP阳性茎段转移至生根培养基上获得完整植株，在熒光体视显微镜下可观察到根部GFP荧光，将所有根部可观察到GFP荧光的植株转移至土壤中，炼苗后置于温室中继续生长。

RGA10-8LRR阳性植株DNA水平鉴定结果如图2所示。在所鉴定的15个转基因株系中，有10个株系的扩增结果与阳性对照pCLB2301-RGA10_RGA8_SK（#1311）质粒的产物大小一致，被鉴定为阳性转基因苗。据Feechan等（2013）的研究结果可知，在MrRPV1和MrRUN1两个基因的第二个外显子处存在选择性剪切，在MrRPV1和MrRUN1转基因苗体内存在4个不同的转录本。由于本研究构建的重组载体是采用基因自身的启动子，因此RNA水平鉴定应检测到4个转录本，即在RT-PCR产物中存在对应的4条电泳条带（图3-A），条带大小分别为2.00、1.20、1.00和0.80 kb。RGA8 LRR部分对应的扩增产物为2.10 kb（图3-B），RGA10-8-43未检测到转录本，RGA10-8-7检测到2个转录本，RGA10- 8-19检测到3个转录本，其他株系均检测到4个转录本，其中第3个转录本的表达量较低。综合以上鉴定结果，本研究共获得7个RGA10-8LRR阳性转基因株系。

RGA8-10LRR阳性植株DNA水平鉴定结果如图4所示。在所鉴定的8个转基因株系中，有7个株系的扩增结果与阳性对照一致，被鉴定为阳性转基因苗。RGA8-10-2株系与阴性对照一致，未扩增出目的片段，被鉴定为假阳性植株。同上，RGA8-10LRR阳性植株的RGA8部分也应该检测到4个转录本，即在RT-PCR产物中存在对应的4条电泳条带（图5-A），条带大小分别为2.00、1.20、1.00和0.80 kb。RGA10LRR部分采用引物对CB631/CB556的扩增产物为1.68 kb（图5-B），RGA8-10-39株系未扩增出目的片段。综合以上鉴定结果，本研究共获得6个RGA8-10LRR阳性转基因株系。

2. 2 RGA10-8LRR阳性植株的霜霉病抗性鉴定结果

对RGA10-8LRR阳性植株进行葡萄霜霉病菌接种，检测结构域互换后的转基因苗是否具有霜霉菌抗性。结果表明，RGA10-8-13植株表现出与MrRPV1转基因苗S8-1一致的坏死斑点，肉眼观察不到白色霜霉状物，而未转基因的西拉葡萄表现出明显的感病症状，叶盘表面长满白色霜霉（图6）。虽然其他6个阳性转基因系未观察到坏死斑，但可观察到明显的白色霜霉状物，对其叶盘进行霜霉菌孢子囊计数，结果发现转基因植株每个叶盘上的霜霉菌孢子囊数与西拉葡萄相比均呈显著（P<0.05）或极显著（P<0.01，下同）的下降趋势（图7）。而白粉病的抗性鉴定结果表明，与MrRUN1转基因苗S10-11相比，RGA10-8LRR转基因苗均未表现出明显的白粉病抗性（图8）。可见，互换后的LRR结构域在一定程度上发挥了病原菌识别作用。

2. 3 RGA8-10LRR阳性植株的白粉病抗性鉴定结果

对GFP荧光观察及DNA和RNA水平检测均呈阳性的6个RGA8-10LRR株系进行葡萄白粉病菌接种，检测LRR结构域互换后的转基因苗对白粉病菌是否具有抗性，结果发现RGA8-10-3和RGA8-10-28两个株系表现出对白粉病的抗性，有35%左右的细胞表现出PCD（图9），与未转基因的西拉葡萄对照相比存在极显著差异，但其他4个株系与未转基因的西拉葡萄对照间无显著差异（P>0.05），未表现出白粉病抗性；同时发现LRR结构域重组后的转基因苗对白粉病菌的抗性较MrRUN1转基因苗的抗性有所降低。霜霉病接种试验结果发现，RGA8-10LRR转基因苗均不抗霜霉病（图10）。表明MrRPV1的LRR结构域被MrRUN1的LRR结构域互换后，在一定程度上起到对白粉病菌的识别作用，但不再介导霜霉病抗性。

3 讨论

植物基因组中存在大量的抗性基因（R基因）以对抗多种多样的病原菌。其中，NBS-LRR类抗病基因是植物抗病基因中主要大類，也是近年来植物抗病基因研究的热点。在NBS-LRR类抗病基因中，LRR结构域直接或间接与病原菌的无毒蛋白（AVR）互作（Jia et al.，2000；Dangl and Jones，2001），因此被认为与病原菌的特异识别有关（Ellis et al.，1999；van der Hoorn et al.，2005）。本研究将MrRPV1和MrRUN1两个蛋白的LRR结构域互换，构建重组表达载体，成功转化西拉葡萄的胚性愈伤组织而获得转基因植株，并通过DNA、RNA分子水平检测和室内接种试验进行抗病性鉴定，筛选出具有抗性性状的转基因株系。这些抗性植株的存在说明MrRPV1和MrRUN1两个抗性蛋白的LRR结构域可能分别介导对白粉病菌和霜霉病菌的特异性识别。本研究还发现，虽然有些转基因株系的PCR检测结果呈阳性，但其并未具有白粉病或霜霉病抗性或抗性与对照相比有所降低。这种现象在其他一些转基因植物（烟草和亚麻）上也曾经观察到（Dinesh-

Kumar et al.，2000；Ellis et al.，2007），其原因主要是：（1）重组后的目的蛋白在某些PCR检测呈阳性的转基因植株体内并未表达。在本研究中，重组蛋白和GFP标签相对独立，二者并非融合蛋白，因此无法使用GFP抗体检测目的蛋白的表达情况。同时，NB-LRR类蛋白在植物体内存在很多的同源基因，且大部分位置均较保守，根据目的蛋白设计特异抗体检测其表达情况的技术尚未成熟。（2）转基因植株的抗病性差异可能与转基因的拷贝数有关。Goodwin等（1996）、郭兴启（2001）研究发现，转基因的拷贝数与转基因植株的抗性呈正相关。因此，在今后的相关研究中宜通过Southern杂交技术检测转基因苗的拷贝数。（3）重组外源基因在基因组中的插入位点不稳定，外源基因整合进目的植物基因组后，极易被植物基因组存在的修饰与限制系统所识别并加以修饰和抑制，使之失活或沉默（Kumpatla et al.，1998）。如果转基因整合进入高度甲基化的染色体区域，其甲基化作用就会波及转基因效果，使目的基因转录失活；若整合到异染色质区或高度重复序列区，则会导致目的基因的表达沉默或下降（夏兰芹等，2000）。

4 结论

MrRPV1的LRR结构域可能介导对葡萄霜霉菌的特异性识别，而MrRUN1的LRR结构域可能介导对白粉病菌的特异性识别。

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（責任编辑 兰宗宝）