周丽霞　吴翼　肖勇

摘要：【目的】應用SSR分子标记对8个油棕品种进行遗传结构及多样性分析，以期通过分析具有高杂合度油棕品种的遗传结构来辅助育种。【方法】利用SSR分子标记及PCR银染显色技术筛选多态性引物，分析8个油棕品种的等位基因频率（P）、观测杂合度（Ho）和期望杂合度（He），计算每个转座子的平均等位基因（Na）、每个多态转座子的平均等位基因数（Na/pl）及有效等位基因数（Ne），计算固定指数（Fis）和F-统计量值（Fit和Fst），并基于遗传距离对8个油棕品种进行聚类分析。【结果】开发出27对多态性SSR引物，从中选取15对结果较好的多态性引物对油棕大样本进行检测，挖掘出57个等位基因（Na），平均每个转座子的Na为3.8个，表明8个油棕品种的遗传变异较明显。平均有效等位基因数（Na）和期望杂合度（He）分别为0.6248和0.5902。此外，发现一个高水平的种群分化，F-统计量值（Fst）变化范围为0.1029～0.6010，平均为0.3664。利用多态性SSR分析8个油棕品种的遗传距离，结果发现品种1和品种3的遗传距离最远（1.674），品种3和品种5的遗传距离最近（0.065）。【结论】8个油棕品种的多态性相对丰富，物种间杂交程度较小，物种亲缘关系较远，遗传多样性良好。

关键词： 油棕；SSR分子标记；遗传多样性；遗传距离

中图分类号： S565.9 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）02-0216-06

Abstract：【Objective】The present study conducted genetic structure and genetic diversity analysis on eight Elaeis guineensis Jacq. varieties using SSR molecular marker， in order to provide references for breeding through analyzing genetic structure of E. guineensis Jacq. varieties with high levels of heterozygosity. 【Method】Using SSR molecular marker and PCR silver-stain technique， the researchers analyzed allele frequencies（P），observed heterozygosities（Ho） and expected heterozygosities（He）， calculated mean number of alleles per transposons（Na）， mean number of alleles per polymorphic transposons（Na/pl） and number of effective alleles（Ne）. Fixation index（Fis） and F-statistic values（Fit and Fst） were also calculated. Clustering analysis on eight E. guineensis Jacq. varieties was conducted based on genetic distance. 【Result】Twenty-seven pairs of polymorphic SSR primers were developed，fifteen pairs of polymorphic primers with good results were selected for testing E. guineensis Jacq. large sample. Fifty-seven alleles（Na） were detected，and Na per transposons was 3.8 on average， which showed that the genetic variation of eight E. guineensis Jacq. varieties was obvious. Average effective alleles（Ne） was 0.6248 and expected heterozygosity（He） 0.5902. A high-level population differentiation was found， F-statistic value（Fst） ranging from 0.1029 to 0.6010 and being 0.3664 on average. Polymorphism SSR was applied to analyze genetic distance of the eight E. guineensis Jacq. varieties. The results indicated that genetic distance between Variety 1 and Variety 3 was the longest（1.674）， and genetic distance between Variety 3 and Variety 5 was the shortest（0.065）. 【Conclusion】The eight E. guineensis Jacq. varieties enjoy abundant polymorphism， small hybridization degree between species， far species polygenetic relationship and sound genetic diversity.

Key words： Elaeis guineensis Jacq.； SSR marker； genetic diversity； genetic distance

0 引言

【研究意义】油棕（Elaeis guineensis Jacq.）属棕榈科单子叶多年生木本油料作物，在我国海南、广西等省（区）均有种植，其果实含油量较高，具有重要的社会经济价值（熊惠波等，2010）。种质资源的丰富程度是影响油棕产业发展的主要因素之一，而遗传多样性决定种质资源的丰富度，也是物种和个体适应外界环境和进化的前提（Bracco et al.，2009）。近年来，DNA分子标记技术的快速发展为植物遗传多样性分析和品种鉴定提供了新思路，其中，SSR分子标记具有单碱基高分辨率、可检测等位基因、所需DNA样本量少和重复性好等优点（Eujay et al.，2004；Blair et al.，2011），被认为是进行植物遗传研究最理想的分子标记。因此，利用SSR分子标记技术考察油棕的遗传多样性，可为其育种资源的选择及遗传改良提供理论依据。【前人研究进展】SSR是用于物种遗传多样性分析及分子标记辅助育种的重要标记之一。詹永发等（2015）采用形态学和SSR标记聚类分析法将贵州97个辣椒种质资源分成五大类群， 为进一步发掘和利用当地丰富的辣椒品种资源提供了参考依据；赵君等（2015）利用均匀分布于棉花26条染色体上的370对SSR标记对32个棉花品种（系）进行遗传多样性分析，发现高含油量品种（系）与低含油量品种（系）的遗传差异明显，遗传距离远，其中高含油量种质资源的遗传基础较丰富；高旭等（2016）利用SSR分子标记对全国156份籽粒高粱进行全基因组基因分型，并通过聚类分析和主坐标分析将156份高粱资源划分为三大类群，为粒用高粱资源的科学利用和新品种选育提供了参考；Zhao等（2016）利用74对SSR引物对134份耐盐处理的棉花样本进行分析，开发出8对耐盐相关SSR分子标记，为协助棉花的分子辅助育种工作打下了基础。高通量测序技术的快速发展促进了目标性状相关SSR分子标记的开发及应用，如Xiao等（2014）通过分析油棕对照组和冷处理组转录组测序数据，找到5791个SSR位点，在182对多态性SSR引物中有137对可定位到油棕染色体上，同时，通过分析油棕低温处理组转录组数据，发现1个ICE1同源基因、5个CBF同源基因、19个NAC转录因子和4个冷诱导同源基因；Zhang等（2014）通过挖掘454组转录组测序数据，开发了57对可用于分析黄鲇鱼群体结构的EST-SSR分子标记；Feng等（2016）通过分析药用杭白菊转录组数据，新开发了17对EST-SSR分子标记，并对32个杭白菊栽培品系进行了基因多样性分析，显示SSR分子标记技术可根据起源及生态分布用于杭白菊分类分析。【本研究切入点】遗传多样性很大程度上决定着生物多样性，但目前我国对油棕遗传结构及群体多样性的研究相对较少。【拟解决的关键问题】通过分析油棕转录组测序数据，挖掘可用于评价油棕品种遗传多样性的SSR分子标记，并利用SSR分子标记对8个油棕品种进行遗传结构及多样性分析，以期通过分析具有高杂合度油棕品种的遗传结构来辅助育种。

1 材料与方法

1. 1 试验材料及其DNA提取

8个油棕品种分别采自云南、广西和海南（表1）。采用盆栽方法，塑料盆体高约40 cm，直径约30 cm，每盆装土约7.5 kg。油棕为半年生实生苗，同一期培育，植株大小相近，高约70 cm，地径30～35 cm，每品种20盆，每盆1株。采集油棕嫩叶，每株采集1份叶片，每品种采样20份，采用CATB法提取叶片DNA（周丽霞等，2013），-20 ℃保存备用。

1. 2 油棕转录组数据和SSR位点分析

通过转录组测序得到51452条油棕转录组序列，结合生物信息学分析进行SSR位点搜索，找到5791个SSR位点，平均10个表达序列中含有1个SSR位点。应用Primer 5.0设计引物，并随机选取100对进行筛选。其中引物设计标准为：（1）引物长度在18～25 bp；（2）退火温度在55～60 ℃；（3）GC最佳含量在50%左右，尽量避免出现引物二级结构、二聚体；（4）PCR扩增产物大小应在100～300 bp。

1. 3 PCR扩增

PCR扩增体系10.0 μL：10×Buffer（Mg2+） 1.0 μL，1 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL，dNTP MIX 0.2 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，ddH2O 5.6 μL，50 ng/μL DNA模板2.0 μL，向体系中加入10.0 μL无菌液体石蜡油，在TP1600梯度PCR仪上进行扩增。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，58.4 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行35个循环；72 ℃延伸7 min。最后将PCR产物进行1%聚丙烯酰胺凝胶电泳1.5 h，银染显色。

1. 4 数据分析

根据转录谱数据找到表达差异在2倍以上的基因，应用Mastfinder分析基因序列SSR位点，并采用Primer 5.0设计引物，应用POPGENE 1.32进行8个油棕品种的遗传多样性分析，包括等位基因频率（P）、观测杂合度（Ho）和期望杂合度（He），计算每个转座子的平均等位基因（Na）、每个多态转座子的平均等位基因数（Na/pl）及有效等位基因数（Ne），同时计算固定指数（Fis）和F-统计量值（Fit和Fst）（Nei，1973；Eloi et al.，2012）。采用UPGMA制图评估不同品种间的遗传距离（Wright，1965）。

2 结果与分析

2. 1 SSR引物筛选及8个油棕品种多态性分析结果

从160份油棕样本中随机选取24份，对100对SSR引物进行筛选分析，其中73对引物的PCR结果为1条条带，27对引物呈多态性（部分PCR结果见图1）。由图1可看出，油棕样本PCR目标条带清晰，且均存在2条以上条带，大小与预期值相符，该结果初步表明引物多态性较好。从中选取结果较好的15对引物（表2）进行大样本检测，引物多态性分析結果见表3。

选取15对引物对油棕大样本进行检测，结果（表3）共挖掘出57个等位基因（Na），平均每个转座子的Na为3.8个。有效等位基因数（Ne）和期望杂合度（He）在15个SSR中存在较大差异，Ne最大值（4.3189）和He最大值（0.8630）出现在具有三碱基重复[（CTC）6]单元的SSR11，Ne最小值（1.5936）和He最小值（0.3305）出现在具有三碱基重复[（TCC）5]单元的SSR5。所有SSR的Ne平均值为2.6248，He平均值为0.5902。较大的Ne和He（>0.50）出现在12个SSR转座子中（SSR1～SSR4、SSR6和SSR8～SSR14），表明80%的SSR转座子可完成对8个油棕群体的区分。8个SSR转座子（53.34%）的固定指数（Fis）是正值，负值出现在SSR3、SSR6和SSR9～SSR13，表明46.66%的杂交群体中有SSR转座，该杂交群体存在大量的遗传变异。F-统计量值（Fst）可用于评估油棕品种的分化水平，8个油棕品种的Fst变化较明显，为0.1029～0.6010，平均为0.3664，表明36.64%等位基因频率的变化是由8个油棕品种的遗传差异所引起。

3 讨论

常用的分子标记技术，如AFLPs、RAPDs和RFLP等已在油棕基因型分析、挖掘与目标性状相关联分子标记等方面得到广泛应用（Billotte et al.，2005；Cochard et al.，2009），但这些分子标记技术均是通过电泳技术进行基因型分型，分析的数据量相对较少，通量较低。近年来，随着高通量测序技术的发展，结合生物信息学分析，多态性SSR分子标记的开发更快速和高效。该技术已广泛应用于开发与目标性状紧密相联的SSR分子标记（Das and Rao，2015； Kumar et al.，2015），为分子遗传育种、群体多样性分析及遗传结构鉴定打下了基础。越来越多的研究者通过对油棕进行转录组测序来解读与重要农业性状相关联的分子机理，并挖掘了大量的ESTs（Tranbarger et al.，2011），如Low等（2008）为了解在油棕组织培养过程中的基因表达情况，开发了648条与组织培养相关联的EST-SSRs，为体细胞胚胎发生相关联的候选基因鉴定提供了条件。

目前，我国的油棕资源主要分布在海南、广西等地，种植面积虽较广，但对油棕种质资源的群体结构、杂交度等方面的评估相对较少，可用于分析其遗传结构多样性的SSR分子标记数量十分有限，在很大程度上制约着我国油棕遗传育种的进程，进而限制了油棕产业的发展。肖勇等（2013）应用NCBI网站上公布的EST序列对18份油棕资源进行SSR标记的开发，结果发现有25个油棕SSR标记具有中度多样性。本研究以收集的8个油棕品种（160份油棕样本）为基础研究材料，通过高通量测序获得油棕转录组数据，结合生物信息学分析，设计引物并进行PCR多态性筛选，结果发现100对引物中有27对多态性SSR引物序列，通过PCR结果初步判断引物具有明显多态性。从中选择15对引物对8个品种进行SSR多态性分析，结果显示，8个油棕群体的Ho和He分别为0.1174～0.9261和0.2346～ 0.5547，变化范围较大，说明油棕品种的遗传多样性丰富；同时，对8个油棕品种进行聚类分析，结果表明8个油棕品种的多态性相对丰富，物种间杂交程度不明显，物种亲缘关系较远。与肖勇等（2013）的研究结果相比，本研究中油棕转录组数据通过高通量测序获得，相对从NCBI网站下载公布的EST序列来说，数据量变大，分析更全面准确，且油棕样本是从云南、广西和海南3个不同地点收集而来，样本来源较丰富，相对能代表我国油棕现有的种植情况和群体结构。本研究结果较系统地分析了国内油棕资源的遗传结构，明确了品种的多样性，为油棕的遗传育种工作打下了基础。

4 结论

本研究基于转录组测序技术开发了27对多態性SSR分子标记，并从中选择15对多态性较好的SSR分子标记对8个油棕品种的遗传多样性进行研究，结果发现8个油棕品种间杂交程度很小，遗传多样性良好。该结论可为油棕育种资源的挖掘及分子辅助育种提供参考。

参考文献：

高旭，周棱波，张国兵，邵明波，张立异. 2016. 基于SSR标记的粒用高粱资源遗传多样性及群体结构[J]. 贵州农业科学，44（9）：13-19.

Gao X，Zhou L B，Zhang G B，Shao M B，Zhang L Y. 2016. Genetic diversity and population structure of grain sorghum germplasm resources based on SSR marker[J]. Guizhou Agricultural Sciences，44（9）：13-19.

肖勇，杨耀东，夏薇，沈雁，雷新涛，马子龙. 2013. 25个油棕SSR标记的开发及应用这些标记评估油棕资源的遗传多样性[J]. 江西农业学报，25（12）：27-31.

Xiao Y，Yang Y D，Xia W，Shen Y，Lei X T，Ma Z L. 2013. Development of 25 SSR markers and their uses in evaluating genetic diversity of oil palm germplasm resources[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，25（12）：27-31.

熊惠波，曹红星，孙程旭，范海阔，马子龙. 2010. 油棕育种的研究进展和展望[J]. 中国农学通报，26（2）：277-279.

Xiong H B，Cao H X，Sun C X，Fan H K，Ma Z L. 2010. The progress and prospects of oil palm breeding[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，26（2）：277-279.

詹永發，王海，张万萍. 2015. 贵州辣椒种质资源的多样性[J]. 贵州农业科学，43（10）：1-7.

Zhan Y F，Wang H，Zhang W P. 2015. Genetic diversity of pepper germplasm resources in Guizhou[J]. Guizhou Agricultural Sciences，43（10）：1-7.

赵君，刘剑光，吴巧娟，赵亮，许剑文，肖松华. 2015. 棉花种质种仁含油量测定及其遗传多样性分析[J]. 江苏农业学报，31（5）：975-983.

Zhao J，Liu J G，Wu Q J，Zhao L，Xu J W，Xiao S H. 2015. Kernel oil content and genetic diversity of upland cotton germ-

plasm[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，31（5）：975-983.

周丽霞，肖勇，杨耀东，马子龙. 2013. 油棕基因组DNA 3种提取方法的比较研究[J]. 江西农业学报，25（8）：9-11.

Zhou L X，Xiao Y，Yang Y D，Ma Z L. 2013. Comparison of three extract methods for genomic DNA of Elaeis guineensis[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，25（8）：9-11.

Billotte N，Marseillac N，Risterucci A M，Adon B，Brottier P，Baurens F C，Singh R，Herran A，Asmady H，Billot C， Amblard P， Durand-Gasselin T， Courtois B， Asmono D， Chean S C， Rohde W， Ritter， Charrier A. 2005. Microsatellite-based high density linkage map in oil palm（Elaeis guineensis Jacq.）[J]. Theoretical and Applied Genetics，110： 754-765.

Blair M W，Hurtado N，Chavarro C M，Munoz-Torres M C，Giraldo M C， Pedraza F， Tomkins J，Wing R. 2011. Gene-based SSR markers for common bean（Phaseolus vulgaris L.）derived from root and leaf tissue ESTs： An integration of the BMc series[J]. BMC Plant Biology，11： 50.

Bracco M，Lia V V，Gottlieb A M，Camara Hernandez J， Poggio L. 2009. Genetic diversity in maize landraces from indigenous settlements of northeastern Argentina[J]. Genetica，135（1）： 39-49.

Cochard B，Adon B，Rekima S，Billotte N，Chenon R D，Koutou A，Nouy B，Omore A，Purba A R，Glazsmann J C， Noyer J L. 2009. Geographic and genetic structure of African oil palm diversity suggests new approaches to breeding[J]. Tree Genet Genomes，5（3）： 493-504.

Das G，Rao G J. 2015. Molecular marker assisted gene stacking for biotic and abiotic stress resistance genes in an elite rice cultivar[J]. Frontiers in Plant Science，6： 698-673.

Eloi I B O，Mangolin C A，Scapim C A， Goncalves C S， Machado M F P S. 2012. Selection of high heterozygosity popcorn varieties in Brazil based on SSR marker[J]. Genetics and Molecular Research，11（3）： 1851-1860.

Eujay I，Sledge M K，Wang L， May G D， Chekhovskiy K， Zwontitzer J C， Mian M A R. 2004. Medicago truncatula EST-SSRs reveal cross-species genetic markers for Medicago spp[J]. Theoretical and Applied Genetics，108： 414-422.

Feng S G，He R F，Lu J J，Jiang M Y，Shen X X，Jiang Y，Wang Z A，Wang H Z. 2016. Development of SSR markers and assessment of genetic diversity in medicinal Chrysanthemum morifolium cultivars[J]. Frontiers in Genetics，7： 1-11.

Kumar M，Choi J Y，Kumari N，Pareek A，Kim S R. 2015. Molecular breeding in Brassica for salt tolerance： Importance of microsatellite（SSR）markers for molecular breeding in Brassica[J]. Frontiers in Plant Science，6： 688-695.

Low E T L，Alias H，Boon S H，Shariff E M，Tan C Y A，Ooi L C，Cheah S C，Raha A R，Wan K L，Singh R. 2008. Oil palm （Elaeis guineensis Jacq.）tissue culture ESTs： Identifying genes associated with callogenesis and embryogenesis[J]. BMC Plant Biology，8： 62.

Nei M. 1973. Analysis of gene diversity in subdivided populations[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 70（12）： 3321-3323.

Tranbarger T J，Dussert S，Jot T，Argout X，Summo M，Champion A，Cros D，Omore A，Nouy B，Morcillo F. 2011. Regulatory mechanisms underlying oil palm fruit mesocarp maturation，ripening，and functional specialization in lipid and carotenoil metabolism[J]. Plant Physiology，156： 564-584.

Wright S W. 1965. The interpretation of population structure by F-statistics with special regard to systems of mating[J]. Evolution，19（3）： 395-420.

Xiao Y，Zhou L X，Xia W，Mason A S， Yang Y D， Ma Z L， Peng M. 2014. Exploiting transcriptome data for the development and characterization of gene-based SSR markers related to cold tolerance in oil palm（Elaeis guineensis）[J]. BMC Plant Biology， 14： 384-396.

Zhang J，Ma W G，Song X M，Lin Q H， Gui J F， Mei J. 2014. Characterization and development of EST-SSR markers derived from transcriptome of Yellow Catfish[J]. Molecules，19（10）： 16402-16415.

Zhao Y L，Wang H M，Shao B X，Chen W，Guo Z J，Gong H Y，Sang X H，Wang J J，Ye W W. 2016. SSR-based association mapping of salt tolerance in cotton（Gossypium hirsutum L.）[J]. Genetics and Molecular Research，15（2）： gmr.15027370.

（責任编辑 王 晖）