张展，徐娜，李爱萍，刘慧，王媛媛

(郑州大学第三附属医院,郑州 450052)

MiR-34a对JAR细胞自噬影响的机制

张展，徐娜，李爱萍，刘慧，王媛媛

(郑州大学第三附属医院,郑州 450052)

目的 探讨miR-34a对人胎盘绒毛癌细胞JAR细胞自噬影响的机制。方法 选取JAR细胞，随机分为miR-34a 模拟物组(转染miR-34a 模拟物)、NC组(转染模拟物阴性对照)、miR-34a抑制物组(转染miR-34a抑制物)、INC组(转染抑制物阴性对照)、空白对照组(只加Lipofectamine 2000)、缺氧组(300 μmol/L氯化钴处理)和正常组(未经氯化钴处理)。采用Real time PCR法检测各组miR-34a及HMGB1 mRNA表达，Western blotting法检测各组HMGB1和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达,透射电镜检测各组细胞中自噬小体形成情况。结果 miR-34a模拟物组中HMGB1 mRNA和蛋白表达水平较NC组降低(P<0.05)，miR-34a抑制物组中HMGB1 mRNA和蛋白表达较INC组高(P<0.05)。缺氧组中HMGB1和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达较正常组升高。缺氧处理后miR-34a模拟物组中 HMGB1和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的相对表达量较INC组降低(P<0.05)，miR-34a抑制物组中HMGB1和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的相对表达量较INC组升高(P<0.05)。透射电镜结果显示，缺氧组自噬小体的数量较正常组明显增加(P<0.05)，缺氧处理后miR-34a模拟物组细胞中自噬小泡数量较NC组减少(P<0.05)，miR-34a抑制物组细胞中自噬小泡数量较INC组增加(P<0.05)。结论 miR-34a可能通过抑制HMGB1表达影响滋养细胞的自噬。

子痫前期；JAR细胞；自噬；微小RNA-34a

子痫前期(PE)是常见的妊娠期并发症之一，严重危害母亲和胎儿健康[1]。目前，关于PE的病因及发病机制尚不完全清楚。研究指出，绒毛膜外滋养细胞(EVTs)侵袭障碍导致PE的病理生理学改变[2]，而EVTs的侵袭能力又受到细胞自噬的影响。自噬是细胞回收胞质成分的一种降解系统[3]，是维持细胞稳态的一种机制，在营养缺乏、缺氧、应激等条件下，通过胞质内成分的再利用给细胞补充营养，并选择性地降解受损的细胞器。目前人类胎盘疾病中自噬的研究不多。Soo-Young等[4]研究发现，PE患者的胎盘组织中，自噬相关蛋白LC3Ⅱ的表达水平升高，滋养细胞的过度自噬导致细胞功能受损致自噬性细胞死亡，影响滋养细胞的侵袭能力[5]。microRNA(miRNAs)是一类长度约22个核苷酸大小的内源性非编码小RNA，不完全互补地结合到靶mRNA的3'端非编码区，通过抑制翻译或裂解靶mRNA从而调节转录后的基因表达。miRNAs的异常表达与人类多种疾病相关，如癌症、炎症和心血管疾病[6]。研究发现，诸多miRNAs在胎盘发育中发挥重要作用，其中包括miR-34a。miR-34a属于miRNA-34,位于染色体1p36。研究发现，miR-34a在胎盘组织中表达下调，可抑制高迁移率族蛋白(HMGB1)mRNA表达及滋养细胞侵袭[7]。然而，miR-34a不仅与细胞的侵袭转移有关，还可调节细胞的自噬，但在PE中miR-34a与滋养细胞自噬的关系尚不清楚。HMGB1是一种非组蛋白染色体结合蛋白，具有致炎和核内转录功能，亦是诱导和调节细胞自噬的重要因子[8]。HMGB1在PE中表达升高，但与miR-34a和滋养细胞自噬的关系目前尚不清楚。2016年3月，我们观察了miR-34a对HMGB1表达的影响及在滋养细胞自噬中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 选取郑州大学第三附属医院的人绒毛膜癌细胞系JAR细胞作为研究对象，其生物学行为与滋养细胞相似。主要试剂：RPMI1640 培养基购自Hyclone公司，胎牛血清为杭州四季青公司产品，miR-34a 模拟物、miR-34a 抑制物及他们的阴性对照购自上海吉玛公司，Opti-MEM购自GIBCO公司，Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，TRolzon购自北京康为生物科技有限公司，RIPA细胞裂解液购自北京索莱宝科技有限公司，qPCR逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR Master Mix购自日本东洋纺公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。HMGB1兔抗人一抗购自Abcam公司，微管相关蛋白1轻链3(LC3)兔抗人一抗购自CST公司，内参β-actin 鼠抗人一抗购自Abcam公司。

1.2 miR-34a干预后JAR细胞HMGB1 mRNA及蛋白表达检测 将细胞分为5组：miR-34a模拟物组(转染miR-34a模拟物)、NC组(转染模拟物阴性对照)、miR-34a抑制物组(转染miR-34a抑制物)、INC组(转染抑制物阴性对照)和空白对照组(只加Lipofectamine 2000)。转染24 h后按照TRIzol的说明书提取各组总RNA，提取过程在冰上操作以防RNA降解。按逆转录试剂盒说明书进行逆转录并按照实时荧光定量PCR说明书进行扩增，Real time PCR所用引物：miR-34a 上游引物：5′-ATTGCGGTGGCAGTGTCTTAGCT-3′，下游引物：5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′，HMGB1上游引物5′-GAACATCCTGGCCTGTCCAT-3′，下游引物：5′-GCAAACCCACACTTCTTACCT-3′，miRNA和mRNA的内参分别采用U6和β-actin,miRNA和mRNA表达量的改变倍数采用2-ΔΔCt计算。转染48 h后使用索莱宝的RIPA细胞裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度。采用5%的浓缩胶和15%的分离胶进行电泳。蛋白上样量为每孔20 μg。采用湿转法将胶上的蛋白转至硝酸纤维素膜上，HMGB1及β-actin转膜1 h,5%脱脂奶粉室温摇床封闭1 h,封闭结束后将膜置于杂交袋内，分别与各自的一抗，4 ℃孵育过夜。洗膜后，用荧光标记的二抗，杂交袋内室温孵育2 h,洗膜，用ODYSSEY Clx检测与成像系统进行分析。计算目的条带与内参条带的灰度值之比，即为目的蛋白的相对表达量。

1.3 缺氧干预后细胞中HMGB1、LC3蛋白表达及自噬小体数量检测 将细胞分为两组：缺氧组(300 μmol/L氯化钴处理)和正常组(未经氯化钴处理)。采用Western blotting方法检测各组细胞中HMGB1和LC3Ⅱ/Ⅰ的相对表达量；转染后各组的细胞，去除培养基，PBS冲洗2～3次，刮下细胞，置于预冷的5%戊二醛固定液中4 ℃固定过夜。后经1%锇酸固定2 h、丙酮梯度脱水、环氧树脂812浸透包埋，并制成70 nm超薄切片，经枸橼酸铅和乙酸铀电子染色，透射电镜观察并计数细胞自噬小体数量。

1.4 miR-34a干预JAR细胞后自噬小体数量检测 将细胞分为miR-34a模拟物组、NC组、miR-34a抑制物组、INC组，转染48 h后300 μmol/L氯化钴处理2 h,诱导细胞产生自噬。提取各组细胞总蛋白，采用Western blotting方法检测各组细胞中HMGB1和LC3Ⅱ/Ⅰ的相对表达量，按照1.3中的透射电镜方法检测各自细胞中自噬小体的数量。

2 结果

2.1 miR-34a对JAR细胞HMGB1 mRNA及蛋白表达的影响 Real time PCR结果显示，miR-34a模拟物组HMGB1的mRNA水平明显下降，miR-34a抑制物组中HMGB1的mRNA水平显著升高，与空白对照组相比，差异有统计学意义(P均<0.05)；Western blotting结果表明，miR-34a模拟物组，HMGB1蛋白表达明显低于空白对照组(P<0.05)；miR-34a抑制物组中HMGB1蛋白水平明显高于空白对照组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组细胞中miR-34a和HMGB1 mRNA表达比较(±s)

注：与NC组和空白对照组相比，*P<0.05；与INC组和空白对照组相比，△P<0.05。

2.2 缺氧对JAR细胞中HMGB1和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达及细胞自噬的影响 与正常组相比，缺氧组中HMGB1和LC3Ⅱ/Ⅰ的相对表达量明显升高，分别为1.20±0.10和1.06±0.08，差异有统计学意义(P<0.05)；缺氧组能观察到明显自噬小体，而正常组很难观察到。

2.3 miR-34a对JAR细胞自噬的影响 miR-34a模拟物组中HMGB1蛋白表达水平为0.56±0.13，低于NC组的1.04±0.43(P<0.05)；自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ为0.48±0.02，明显低于NC组的1.01±0.03(P<0.05)；miR-34a抑制物组中HMGB1蛋白表达水平明显高于INC组(1.70±0.24 vs 0.82±0.17),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ高于INC组(1.48±0.09 vs 0.99±0.06,P<0.05)。与NC组相比，miR-34a模拟物组中自噬小体数量明显减少，与INC组相比，miR-34a抑制物组中自噬小体数量增多。

3 讨论

miR-34a作为肿瘤抑制基因，在多种肿瘤发生发展中起作用，如子宫内膜癌、前列腺癌、神经母细胞瘤和胎盘相关疾病等[9,10]。有报道显示miR-34a在PE胎盘组织中表达降低[7]。miR-34a不仅与细胞侵袭和凋亡关系密切，亦与细胞自噬相关。自噬是细胞通过溶酶体途径降解细胞内成分的一种代谢过程，是细胞对氧化应激及其他环境刺激的适应，有利于细胞生存[11]。在急性肾损伤、心血管疾病及前列腺癌中均发现miR-34a可抑制细胞自噬。本实验结果显示，缺氧处理后，细胞中自噬相关蛋白LC3表达水平升高，自噬小泡数量增加，说明缺氧确实可诱导JAR细胞产生自噬，而转染miR-34a模拟物并缺氧处理后，LC3表达水平降低，自噬小泡数量明显减少，缺氧诱导的自噬受到抑制，而转染miR-34a抑制物并缺氧处理后，LC3表达水平升高，自噬小泡数量增加，缺氧诱导的自噬进一步增加，由此推测miR-34a可调节滋养细胞的自噬。但miR-34a通过何种分子机制调节滋养细胞自噬仍需进一步探究。Liu等[12]曾报道，miR-34a通过下调HMGB1抑制视网膜母细胞瘤细胞的自噬，增强了化疗诱导的视网膜母细胞瘤细胞的凋亡，因此推测，miR-34a可能通过调节滋养细胞中HMGB1表达从而影响滋养细胞的自噬。本实验结果显示，转染miR-34a模拟物后，HMGB1 mRNA水平和蛋白明显降低，转染miR-34a抑制物后则出现相反结果，推测HMGB1可能是miR-34a的靶基因。

HMGB1是一种非组蛋白的染色质结合蛋白，表达于多种类型细胞，并参与多种疾病的发生发展。目前HMGB1在PE的研究中多与炎症反应有关[9]，但最近研究表明，HMGB1在调节细胞自噬中有重要作用，HMGB1通过与自噬蛋白Beclin1结合，使Beclin1-Bcl2分离，继而诱导自噬的发生[13]。在本实验中，JAR细胞转染miR-34a模拟物后，HMGB1蛋白表达表达降低同时，细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ表达亦明显降低，细胞中自噬小泡数量明显减少，即细胞自噬水平降低，而转染miR-34a抑制物后，HMGB1蛋白表达升高，LC3Ⅱ/Ⅰ表达升高，自噬小泡数量增加，细胞自噬水平亦升高。表明HMGB1表达与细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ表达一致，即HMGB1蛋白的升高或降低与滋养细胞自噬水平一致，推测HMGB1与JAR细胞自噬相关，结合前文HMGB1可能是miR-34a的靶基因，推测miR-34a可能通过调节HMGB1表达而影响滋养细胞的自噬。

研究[4]表明，自噬相关蛋白LC3在PE胎盘组织中表达升高，而Beclin1降低。Saito等[14]发现，缺氧诱导了滋养细胞自噬的活化，PE的氧化应激增加使EVTs过度自噬，导致滋养细胞侵袭失败、胎盘血管重建障碍。本研究结果显示，缺氧可诱导滋养细胞自噬，转染miR-34a模拟物后缺氧诱导的JAR细胞自噬受抑，而转染miR-34a抑制物后自噬水平升高。低表达的miR-34a可能通过上调HMGB1表达致滋养细胞自噬增加，而滋养细胞自噬过度激活致滋养细胞发生自噬性死亡，从而使其侵袭能力降低和胎盘血管形成障碍，进而影响胎盘形成，参与PE的发生发展。可见，自噬不足和过度自噬均将影响滋养细胞功能，从而参与PE的病理生理发展。

总之，本实验首次探究了miR-34a可能通过调节HMGB1表达影响滋养细胞自噬，参与PE的发病，但滋养细胞自噬在PE发病机制中的具体作用仍需进一步研究。

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