米源，杜媛鲲，廖海江，王林，王雷

(1河北医科大学第四医院，石家庄050011;2河北医科大学期刊社)

GANT61对人胃癌细胞生长的影响及机制

米源1，杜媛鲲2，廖海江1，王林1，王雷1

(1河北医科大学第四医院，石家庄050011;2河北医科大学期刊社)

目的 探讨锌指蛋白(Gli)特异性抑制剂GANT61对人胃癌细胞AZ521和AGS生长的影响及机制。方法 用不同终浓度的GANT61处理AZ521和AGS 细胞72 h后，采用MTS法检测GANT61对肿瘤细胞活力的影响；Western blotting法检测GANT61作用于AZ521和AGS细胞24 h后Gli-1、Gli-2、CyclinD1和p21蛋白表达。流式细胞术检测GANT61作用于AZ521和AGS细胞24 h后细胞周期。结果 GANT61作用于AZ521和AGS的IC50分别是7.94、12.70 μmol/L，GANT61作用后，AZ521和AGS细胞中Gli-1、Gli-2、CyclinD1蛋白表达显著下调(P均<0.05)，p21蛋白表达增加(P均<0.05)。GANT61处理AZ521和AGS细胞24 h后G0/G1期细胞所占比例增高(P均<0.05)。结论 GANT61可显著抑制人胃癌细胞AZ521和AGS生长；其机制可能与下调Gli-1、Gli-2、CyclinD1蛋白表达,增加p21蛋白表达有关。

胃癌；锌指蛋白特异性抑制剂；锌指蛋白；细胞周期蛋白D1；p21蛋白；细胞周期

世界范围内每年胃癌新发病例超过100万，年死亡人数约达70万[1]。研究发现,Hh通路的上下游出现异常活化均可致肿瘤的进展和转移[2]。Hh通路在甲状腺癌[3]、淋巴瘤[4]和恶性胸膜间皮瘤[5]等多种肿瘤组织中异常激活，与肿瘤的增殖和转移密切相关。Yoo等[6]研究发现Hh信号通路在胃癌组织中过度活化且与胃癌发生发展及淋巴结转移和预后相关，应用Hh通路抑制剂可下调胃癌细胞的侵袭能力。锌指蛋白(Gli)1和Gli2作为Hh信号通路的下游关键核转录因子，起到转录激活作用，在多种肿瘤中异常高表达且参与肿瘤的发生发展。目前针对胃癌细胞中Hh下游核心靶点Gli1和Gli2与肿瘤生长转移关系的研究较少。2016年3月，我们应用Gli的特异性抑制剂GANT61阻断人胃癌细胞系AZ521和AGS细胞中Hh通路，观察Gli对胃癌细胞生长作用的影响并初步探讨GANT61抗肿瘤作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃腺癌细胞系AZ521和AGS购自英国Sigma-Aldrich公司，伊格尔氏(EMEM)最低限度必需介质培养液、F12(Ham)液体培养液(美国Gibco公司)，胎牛血清(美国Gemini公司)，GANT61(美国Selleckchem公司)，DMSO(美国MPBIO公司)，CellTiter-Glo®发光法细胞活力检测试剂盒(美国Promega公司)，蛋白酶抑制剂(德国Roche公司)，M-PER培养细胞总蛋白提取试剂、Pierce-BCA蛋白分析试剂盒(美国Thermo Scientific公司)，Gli-1兔抗人多克隆抗体(美国Abcam公司)，Gli-2兔抗人多克隆抗体、p21鼠抗人单克隆抗体(美国Thermo Fisher Scientific公司)，细胞周期蛋白D1(CyclinD1)鼠抗人单克隆抗体(美国Cell signaling公司)，GAPDH鼠抗人单克隆抗体(美国Santa Cruz公司),Mini-PROTEAN TGX 预制胶、Tris/甘氨酸/电泳缓冲液(美国BIO-RAD公司)，PVDF膜(德国Millipore 公司)，GloMax-96微孔板发光检测仪(美国 Promega公司)，Epics-XL 型流式细胞仪(美国Beckman-Coulter公司)。

1.2 细胞培养 将人胃癌细胞系AZ521培养于含10%胎牛血清和100 U/mL青-链霉素的EMEM最低限度必需介质培养基；AGS细胞培养于含10%胎牛血清和100 U/mL青-链霉素的F12(Ham)液体培养基，待细胞至70%～80%融合时传代培养。

1.3 细胞活力测算 采用MTS法。将呈对数生长期的胃癌细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，分别用含2%胎牛血清的EMEM重悬AZ521细胞和含2%胎牛血清的F12(Ham)液体培养液重悬AGS细胞，分别以50 μL培养基 /孔(5 000个细胞)接种于96孔培养板中，每个浓度设3个复孔；于37 ℃、5%CO2培养箱内培养过夜后，每孔加入50 μL不同终浓度的GANT61溶液(1.560 7、2.341 1、3.511 6、5.267 5、7.901 2、11.851 9、17.777 8、26.666 7、40 μmol/L)，继续培养72 h，并设空白对照DMSO组。72 h后取出96孔板室温放置10 min，每孔加细胞活力检测试剂100 μL，摇床轻摇30 s后置于避光处10 min，于GloMax-96微孔板发光检测仪检测，选择CellTiter Glo软件读取数据后应用GraphpadPrism 6.1软件分析，得出GANT61作用AZ521和AGS细胞72 h的IC50值。

1.4 AZ521和AGS细胞Gli-1 、Gli-2 、CyclinD1和p21蛋白表达检测 采用Western blotting 法。六孔板内将AZ521(AZ521组)和AGS(AGS组)细胞更换含2%胎牛血清的培养基，加入终浓度为15 μmol/L的GANT61处理24 h，同时设置对照为DMSO组。24 h后用PBS洗涤细胞，每孔加细胞总蛋白提取试剂和蛋白酶抑制剂100 μL，用刮匙收取细胞的蛋白提取液，离心收集上清液，BCA法测定上清液总蛋白浓度。按照每样本上样量为10 μg总蛋白的标准于Mini-PROTEAN TGX 预制胶中上样，在充满Tris/甘氨酸/电泳缓冲液SDS的电泳槽中行电泳，实验条件为200 V,60 min。电泳结束后在Tris-甘氨酸缓冲液中100 V，40 min后将蛋白电转移印迹至PVDF膜上，TBST液洗膜3次，每次10 min，再用5%脱脂奶粉/TBST液封闭PVDF膜1 h后加一抗Gli-1浓度为1∶1 000，一抗CyclinD1浓度为1∶1 000，一抗p21浓度为1∶250，一抗GAPDH浓度为1∶10 000 ，4 ℃过夜，第2天TBST液洗膜3次，每次10 min后分别加抗兔和抗鼠二抗，二抗工作浓度均为1∶20 000，室温孵育1 h后用TBST洗膜洗膜3次，每次10 min，ECL试剂置于PVDF膜上5 min发光，暗室行曝光、显影。实验重复3次。

1.5 细胞周期检测 采用流式细胞术。于六孔板内加入终浓度为15 μmol/L的GANT61分别处理AZ521(AZ521组)和AGS(AGS组)细胞24 h，设置对照为DMSO组。48 h后用PBS洗涤细胞，胰酶消化，收集细胞制成单细胞悬液，70%乙醇固定6 h，调整样品的细胞数为1×106/0.1 mL，加入碘化吡啶1 mL后在4 ℃冰箱染色30 min，上机测每组样本的DNA含量。应用MuticycleAV分析软件对每组样本DNA细胞周期进行拟合分析，实验重复3次。

2 结果

2.1 GANT61对胃癌细胞活力的影响 GANT61作用AZ521和AGS细胞72 h后的IC50值分别是7.94、12.7 μmol/L。

2.2 两组Gli-1、Gli-2、CyclinD1和p21蛋白表达比较 GANT61处理AZ521和AGS细胞24 h后发现Gli-1、Gli-2、CyclinD1蛋白表达显著减少，p21蛋白表达显著增加。AZ521组Gli-1、 Gli-2、CyclinD1蛋白表达分别为0.64±0.03、0.35±0.02、0.21±0.02、1.96±0.04,DMSO组分别为1.00±0.02、1.00±0.03、1.00±0.04、1.00±0.02，两组Gli-1、Gli-2、CyclinD1、p21表达比较，P均<0.05。AGS组Gli-1、Gli-2、CyclinD1、p21蛋白表达分别为0.38±0.03、0.61±0.01、0.79±0.01、6.40±0.03,DMSO组分别为1.00±0.02、1.00±0.03、1.00±0.03、1.00±0.02，两组4项指标比较，P均<0.05。

2.3 两组细胞周期分布比较 AZ521组24 h后G0/G1期细胞比例为(71.33±4.51)%，与DMSO组(58±4)%比较显著增高(P=0.019)；AGS组24 h后G0/G1期细胞比例为(70.67±3.69)%，与DMSO组(52.67±3.79)%比较增高(P=0.004)。

3 讨论

近年来研究发现胃癌中存在多条信号传导通路异常激活的现象，其中针对Her-2等突变基因应用相应的靶向药物取得较好效果[7]，但随其耐药性的出现及部分患者存在Her-2阴性表达，迫使我们寻求新的有效治疗靶点。Hh信号通路是一个高度协调且互相作用的网络，主要包括Hedgehog配体、七次跨膜蛋白Smo、十二次跨膜受体Patched1 和Patched2、转录因子Gli家族(Gli1、Gli2、Gli3)等，通常Ptch与Smo形成复合物，抑制Smo活性，并抑制下游通路。其中Gli1和Gli2上调是Hh通路活化的最重要标志，而Gli3被认为是通路的转录抑制因子。除了经典的Hh通路活化途径外，部分肿瘤亦存在非经典的不依赖Hh活化的Gli激活形式，对肿瘤细胞的周期调控和细胞增殖有重要意义[8]，导致既往针对Hh通路的上游靶点Smo和Hh的抑制剂缺乏高效作用[9]，而针对Gli靶点对Hh信号通路进行调控比针对Smo靶点有更好的抗肿瘤效果[10]。

细胞周期的调控与肿瘤发生密不可分，调控失常可致细胞获得持续的增殖能力。G1～S及G2～M期是细胞周期的主要调控点。CyclinD1是调控G1至S期的最关键细胞周期蛋白，CyclinD1过表达可与CDK4结合形成复合物从而活化CDK4，促进肿瘤细胞G1到S期的转换，促进肿瘤发生。细胞周期抑制蛋白p21是具CDK抑制活性的蛋白，其可与p27抑制CyclinD1活性从而导致细胞周期停止和阻断细胞增殖。

本研究发现GANT61可显著抑制胃癌AZ521和AGS细胞活力而起到抗胃癌作用。进一步研究发现，GANT61具有抗肿瘤细胞增殖的作用，GANT61组与DMSO组相比可阻滞更多肿瘤细胞于G0/G1期。GANT61分别作用AG521和AGS后CyclinD1表达明显降低，p21表达明显升高，推测GANT61调控细胞周期和抗肿瘤机制可能是Hh/Gli信号通路在胃癌细胞中处于活化状态并参与了肿瘤细胞的增殖过程，GANT61可通过特异性抑制胃癌细胞的Gli-1和Gli-2表达从而下调下游靶基因CyclinD1蛋白表达和升高p21蛋白表达来实现对AZ521和AGS细胞的生长抑制作用。

综上所述，GANT61有显著抗肿瘤作用，其抗胃癌作用机制可能与其下调Gli1和Gli2蛋白表达从而抑制肿瘤细胞的活力及阻滞细胞周期等有关。

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河北省医学科学研究重点课题(20160177)。

王雷(E-mail：yuankundu@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.010

R735.2

A

1002-266X(2017)09-0034-03

2016-08-10)