范良，殷铁军

(1华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院，武汉430000;2华中科技大学同济医学院附属同济医院)

CPEB1对人脐静脉血管内皮细胞增殖和迁移的影响及机制

范良1，殷铁军2

(1华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院，武汉430000;2华中科技大学同济医学院附属同济医院)

目的 探讨胞质多聚腺苷酸结合蛋白1(CPEB1)对人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)增殖和迁移的影响及可能机制。方法 取对数生长期的HUVECs细胞，分为实验组与对照组，分别用肿瘤细胞上清液培养基和普通培养基重悬细胞，Real-time PCR法和Western blotting法分别检测CPEB1及整合素-金属蛋白酶17(ADAM17)的mRNA和蛋白表达；取对数生长期HUVECs细胞，待培养至细胞达70%～80%融合时用LipofectamineTM2000进行转染，细胞分为携带基因的质粒转染组(转染组)、不带任何基因的空质粒转染细胞组(转染对照组)和不经任何处理的细胞组(空白对照组)。MTT法检测转染后HUVECs的增殖能力，Transwell小室法检测转染后HUVECs的迁移能力，RT-PCR法检测ADAM17的mRNA表达，Western blotting法检测ADAM17蛋白表达。结果 实验组中CPEB1的mRNA及蛋白表达均低于对照组(P均<0.05)，ADAM17的mRNA及蛋白表达均高于对照组(P均<0.05)；转染48、72 h后，转染组吸光度值低于转染对照组和空白对照组(P均<0.05)；转染组细胞穿过小室膜数目低于转染对照组和空白对照组(P均<0.05)；转染组ADAMl7的mRNA和蛋白表达低于转染对照组和空白对照组(P均<0.05)。结论 CPEB1可抑制HUVECs细胞增殖和迁移，其机制可能与调控ADAM17表达有关。

人脐静脉血管内皮细胞；胞质多聚腺苷酸结合蛋白1；整合素-金属蛋白酶17；细胞增殖；细胞迁移

胞质多聚腺苷酸结合蛋白(CPEBs)是新近发现的一组蛋白，介导mRNA 翻译和胞质多聚腺苷酸化过程，对干细胞的发育、分化和衰老，以及肿瘤的发生发展起重要作用[1]。研究发现，CPEB1在胃癌、乳腺癌、卵巢癌和结肠癌的表达均有下降，且其在肿瘤细胞中的低表达增加了肿瘤的侵袭性[1，2]。但目前国内外对CPEBs 与肿瘤的相关研究较少，有研究发现，CPEB1过表达会抑制HIF-1α的mRNA翻译进而下调HIF-1α蛋白表达[3]，而乏氧因子HIF-1α与肿瘤血管生成密切相关[4]。CPEBs蛋白的作用机制与miRNA的抗肿瘤作用机制相似，均通过作用于其靶基因mRNA的3'-非翻译区域，从而抑制mRNA的翻译过程[1]。本课题组前期研究[5]发现，miRNA-145可能通过调控整合素-金属蛋白酶17(ADAM17)基因表达而抑制人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)的增殖和迁移，且生物信息学软件预测到与肝癌细胞侵袭转移和血管生成密切相关的miR-22与CPEB1高度相关。肿瘤生长离不开血管生成过程，因此，2014年7月，我们探讨CPEBs对HUVECs细胞增殖和迁移的影响及其可能机制，以期明确其在肿瘤血管生成过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 HUVECs和肝癌细胞SMMC-7721购自上海ATCC中心，1640培养基、DMEM/F12培养基、FBS和胰蛋白酶均购自Hyclone公司、兔抗人CPEB1和ADAM17抗体购自Santa Cruz公司，siRNA质粒构建由武汉谷歌生物科技有限公司提供。脂质体转染试剂LipofectamineTM2000和TRIzol试剂均购自美国Invitrogen公司，TaqMan microRNA检测试剂盒购自美国AB公司，MTT购于美国Biomol公司。基质胶购自美国BD公司。本研究主要工作在武汉市中心医院肿瘤分子医学中心和公共实验平台完成，该中心提供激光共聚焦显微镜、 Real-time PCR扩增仪、紫外观测仪及照相系统、酶标仪、离心机、恒压恒流电泳仪、倒置荧光显微镜及照相机、切片机、培养箱、冰箱和细胞超净工作台等。

1.2 细胞培养、分组及转染 HUVECs细胞培养基采用含10%FBS、0.03～0.05 g/L ECGS的1640，置于37 ℃、5%CO2的培养箱培养，调整细胞状态，取对数生长期细胞，调整细胞浓度为4×105/L，将HUVECs铺在6孔板中，待培养至细胞达70%～80%融合时进行细胞转染，用LipofectamineTM2000进行转染，细胞分为携带基因的质粒转染组(转染组)、不带任何基因的空质粒转染细胞组(转染对照组)和不经任何处理的细胞组(空白对照组)。携带基因的质粒用量为8 μg，Lipo2000脂质体用量为20 μL。转染24 h后更换培养基，48 h后收集细胞做下一步实验检测。肿瘤细胞上清液的条件培养基制备：首先用DMEM/F12培养SMMC-7721人肝癌细胞，取含5×105个肝癌细胞的细胞悬液3 mL在50 mL培养瓶中培养，72 h后收集培养的上清液，3 000 r/min离心15 min，弃上清液中的死亡细胞和其他沉淀杂质，过滤后与等体积的含20%FBS的2×1640培养基混合组成含肿瘤细胞上清液的条件培养基。

1.3 肿瘤细胞上清液培养的HUVECs细胞CPEB1和ADAM17 mRNA表达检测 采用 RT-PCR法。取对数生长期的HUVECs细胞，分为实验组与对照组两组，分别用肿瘤细胞上清液培养基和普通培养基重悬细胞，接种于6孔板中，每组设3个复孔，待细胞铺满80%左右时，RT-PCR法检测两组细胞CPEB1和ADAM17 mRNA相对表达量。取各组细胞分别加入TRIzol试剂，按操作说明提取总RNA，反转录得到cDNA。引物设计由广州睿博生物科技有限公司提供，以U6为内参，U6上游引物：5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，U6下游引物：5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。ADAM17上游引物：5′-GGTGGTAGCAGATCATCGCTT-3′，下游引物：5′-GTGGAGACTTGAGAATGCGAA-3′。然后按照反应体系对循环目的基因进行扩增，反应体系共20 μL，先95 ℃ 10 min，然后按照95 ℃ 15 s ，60 ℃ 60 s 扩增40个循环，目的基因按照2-ΔΔCt进行相对定量，每组样本重复试验3次，取平均值统计分析。

1.4 肿瘤细胞上清液培养的HUVECs细胞CPEB1和ADAM17蛋白表达检测 采用Western blotting法。取对数生长期的HUVECs细胞，分为实验组与对照组，分别用肿瘤细胞上清液培养基和普通培养基重悬细胞，取两组HUVECs细胞，分别加入R1PA细胞裂解液进行超声破碎，在4 ℃下约20 000 g离心25 min，上清液为细胞裂解液，可分装在-20 ℃保存，采用BCA法测定蛋白浓度，取相同质量的细胞裂解液，并加等体积的2×电泳加样缓冲液，沸水浴3 min，上样，SDS-PAGE电泳分离样品并进行转膜，加4%BSA封闭1 h后，加入兔抗人一抗，4 ℃孵育过夜后，滴加二抗(1∶1 000)，4 ℃摇床1 h，显影并分析比较，以β-actin为参照。

1.5 细胞增殖能力检测 采用MTT法。取各组细胞，重悬细胞，调整细胞浓度为5×103/mL，取100 mL细胞悬浮液接种于96孔板中，每组分为24、48和72 h 共3个时间点，每个时间节点设3个复孔。待细胞贴壁后，按照每孔15 μL MTT (5 g/L)加入细胞中，继续培养4 h后，每孔再加入150 μL的DMSO，振荡混匀10 min，用酶标仪测定450 nm波长处的吸光度值(OD值)，绘出细胞增殖曲线。

1.6 细胞迁移能力检测 采用Transwell小室法。将各组细胞进行饥饿处理，即更换无血清培养基培养24 h，将基质胶4 ℃条件下预冷，并用无血清培养基稀释成1 mg/mL，混匀，在Transwell小室中每孔加入100 μL的混合液，37 ℃包被1 h，用PBS洗涤3次后消化细胞。重悬浮细胞，调整细胞浓度为1×106/mL，向Transwell小室的上室中加入50 μL的细胞悬浮液，设3个复孔，向小室底部加入100 μL的含血清培养基，37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。吸去上室中的液体，并擦去底部残留的细胞，然后浸入70%的乙醇中固定15 min，PBS洗涤3次，用0.1%的结晶紫染色，晾干，显微镜下每孔随机选择视野进行拍照，计算平均值。

1.7 过表达CPEB1的HUVECs中ADAM17 mRNA及蛋白表达检测 取对数生长期HUVECs细胞，调整细胞浓度为4×105/L，铺于6孔板中，待培养至细胞达70%～80%融合时用LipofectamineTM2000进行转染，细胞分为携带基因的质粒转染组(转染组)、不带任何基因的空质粒转染细胞组(转染对照组)和不经任何处理的细胞组(空白对照组)。HUVECs中ADAM17 mRNA及蛋白表达检测方法同1.3及1.4。

2 结果

2.1 两组HUVECs细胞CPEB1 和ADAM17 mRNA表达比较 实验组与对照组CPEB1 mRNA相对表达量分别为0.32±0.11、0.79±0.16，ADAM17 mRNA相对表达量分别为0.82±0.13、0.22±0.09，两组比较，P均<0.05。

2.2 两组HUVECs细胞CPEB1和ADAM17蛋白表达比较 实验组与对照组HUVECs中CPEB1蛋白相对表达量分别为0.50±0.08、1±0.02，ADAM17蛋白相对表达量分别为1.67±0.21、1±0.01，两组比较，P均<0.05。

2.3 各组HUVECs 细胞增殖能力比较 转染组、转染对照组、空白对照组转染24 h的OD值分别为0.21±0.03、0.19±0.02、0.18±0.02，48 h分别为0.56±0.05、0.75±0.06、0.8±0.07，72 h分别为0.67±0.10、0.90±0.05、0.94±0.09，转染后48、72 h时，转染组HUVECs细胞增殖能力明显低于转染对照组和空白对照组(P均<0.05)。细胞增殖曲线见图1。

图1 过表达CPEB1 蛋白的HUVECs 细胞增殖曲线

2.4 各组HUVECs 细胞迁移能力比较 转染48 h后，转染组、转染对照组、空白对照组穿过小室膜的细胞数目分别为(82.5±22.3)、(210.9±30.5)、(265.2±29.9)个/视野，转染组与转染对照组和空白对照组比较，P均<0.05。

2.5 各组过表达CPEB1的HUVECs中ADAM17 mRNA及蛋白表达比较 转染组、转染对照组、空白对照组HUVECs细胞ADAM17 mRNA相对表达量分别为0.45±0.03、0.89±0.06、0.92±0.07，转染组与转染对照组、空白对照组比较，P均<0.05。转染组、转染对照组、空白对照组HUVECs细胞ADAM17蛋白相对表达量分别为0.62±0.12、0.97±0.14、1±0.01，转染组与转染对照组、空白对照组比较，P均<0.05。

3 讨论

肿瘤微环境中各类细胞的相互作用共同维持肿瘤的各种特性，其中血管新生成机制是肿瘤生长和远处转移的重要病理基础，肿瘤细胞周围的多种细胞因子所形成的微环境有利于新生血管生成[6，7]。肿瘤细胞条件培养基能促进血管内皮细胞的增殖和血管生成，HUVECs被肿瘤细胞上清液刺激后具备肿瘤血管内皮细胞的特性，HUVECs是在细胞水平研究抗肿瘤血管生成机制的标准模型[6，8]。CPEB1在非洲爪蟾卵母细胞中被最初发现，随后在很多非升值细胞中被检测到，并潜在调控目标mRNA长度占到整个基因组的20%左右[9]。CPEBs家族在部分人类肿瘤组织中低表达，且有部分重叠现象，CPEB1通过调节p53、myc和IL-6等细胞因子在细胞衰老过程中发挥重要作用[10]，且其表达降低与恶性细胞的侵袭促进和血管生成能力密切相关。

本研究结果显示，经过肝癌细胞上清液培养的HUVECs细胞中CPEB1 mRNA和蛋白表达均下降，ADAM17 mRNA和蛋白表达均升高，而过表达HUVECs细胞中的CPEB1后，HUVECs细胞的增殖和迁移能力明显受抑。此表明CPEB1和ADAM17在肿瘤发生发展中起重要作用。本实验在HUVECs细胞中过表达CPEB1后发现，ADAM17 mRNA及蛋白表达均下调。ADAM17是ADAM蛋白家族的一员，有金属蛋白酶活性，能降解细胞外基质和脱落或活化细胞表面的配体[11]，ADAM17在肺癌、胰腺癌和乳腺癌等癌症细胞中的表达水平增高，从而促进癌细胞的增殖、侵袭和迁移。研究[12,13]表明，ADAM17还能脱落内皮生长因子并结合血管内皮生长因子受体，调节血管生成。因此，CPEB1可能通过ADAM17调控HUVECs细胞的增殖和迁移。

总之，CPEB1与肿瘤血管发生密切相关，肿瘤细胞上清液刺激HUVECs细胞后，CPEB1表达降低，而ADAM17表达升高，过表达CPEB1后，HUVECs细胞的增殖和迁移能力受抑，其机制可能是通过调控ADAM17实现。

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Effect of CPEB1 on proliferation and migration of HUVECs

FANLiang1,YINTiejun

(1TheCentralHospitalofWuhan,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430000,China)

Objective To investigate the effect of cytoplasmic polyadenylation-element-binding protein 1 (CPEB1) on the proliferation and migration of human umbilical-vein endothelial cells (HUVECs) and its possible mechanism. Methods HUVECs in logarithmic phase were divided into experimental group and control group, which were cultured with tumor cell supernatant medium and the common medium, respectively. Real-time PCR and Western blotting were used to detect the mRNA and protein expression of CPEB1 and a disintegrin and metalloproteinase 17 (ADAM17).HUVECs in logarithmic phase with 70%-80% cells conjugation were transfected by LipofectamineTM2000. Cells were then divided into three group: carrying gene plasmid transfection group (transfection group), without empty plasmid gene transfection group (control group) and without any processing cell group (blank control group). The proliferation ability of HUVECs after transfection was determined by MTT, the migration ability of HUVECs was detected by Transwell chamber, and RT-PCR was used to detect ADAMl7 mRNA expression and Western blotting to detect ADAM17 protein expression.Results CPEB1 mRNA and protein expression levels in the experimental group were lower than those of the control group (allP<0.05). ADAM17 mRNA and protein the expression levels in experimental group were higher than those of the control group (allP<0.05). At 48 h and 72 h after transfection, the absorbance value (A) of the transfection group was obviously lower than those of control group blank control group (allP<0.05). The number of cells through the small chamber membrane in the transfection group was lower than that in the control group and blank control group (allP<0.05). ADAM17 mRNA and protein levels in the transfection group was lower than that in the control group and blank control group (allP<0.05). Conclusion The supernatant of tumor cells can induce the change in expression of CPEB1 and ADAM17 in HUVECs, and over-expression of CPEB1 may inhibit the proliferation and migration of HUVECs by regulating ADAMl7.

human umbilical-vein endothelial cells; cytoplasmic polyadenylation-element-binding protein 1; a disintegrin and metalloproteinase 17; cell proliferation; cell migration

华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院院内科研基金项目(YQ14A03)。

范良(1985-)，男，硕士，主治医师，主要研究方向为肿瘤血管生成机制。E-mail：fanliang5858@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.007

R322.123

A

1002-266X(2017)09-0024-04

2016-08-20)