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结核性脑膜炎患者脑脊液利福霉素钠浓度监测

2017-04-07张晓东姚芳

中国当代医药 2017年5期
关键词:质谱联用脑脊液高效液相色谱

张晓东+姚芳

[摘要]目的 通过高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS/MS)建立结核性脑膜炎患者脑脊液中利福霉素钠的测定方法。方法 采用XTerraRMS C18色谱柱(4.6 mm×100.0 mm,3.5 μm),以醋酸铵(0.01 mol/L)-甲醇(10∶90)为流动相,流速为0.4 ml/min。经HPLC分离,以多反应监测(MRM)测定。结果 本方法在0.4~4.0 μg/ml浓度范围内线性良好(r=0.9997);检出限为100 ng/ml。结论 本方法操作简单,结果准确,可用于结核患者脑脊液中利福霉素钠含量测定。

[关键词]高效液相色谱-质谱联用;结核性脑膜炎;脑脊液;利福霉素钠

[中图分类号] R969 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2017)02(b)-0012-03

[Abstract]Objective To establish a method for determination Rifamycin sodium in the cerebrospinal fluid of patients with tuberculous meningitis by HPLC-MS/MS.Methods Column was XTerraRMS C18(4.6 mm×100.0 mm,3.5 μm).Mobile phase was Ammonium acetate (0.01 mol/L)-Methanol(10:90).Flow rate was 0.4 ml/min.Multiple reaction monitoring(MRM) was used by HPLC.Results The linear ranges of 0.4-4.0 μg/ml (r=0.9997) was better;Detection limit was 100 ng/ml.Conclusion The method is simple,rapid,accurate,and it can be used for therapeutic drug monitoring.

[Key words]HPLC-MS/MS;Tuberculous meningitis;Cerebrospinal fluid;Rifamycin sodium

结核病,又称痨病,是一种古老的传染病,它曾在世界范围广泛流行,并夺取数亿人的生命。自1944年发现链霉素对结核分枝杆菌有效及1962年利福霉素应用于临床以来,异烟肼等大量抗结核药物的出现,开创了以利福霉素、利福平、异烟肼为主的结核化疗时代,并使流行得到了一定的控制。结核性脑膜炎(tubercular meningitis,TBM)是由于结核分枝杆菌感染所致的中枢神经系统感染性疾病,是结核病中最严重的一种,若治疗不及时,可导致严重的神经系统并发症,最终引起患者死亡或遗留严重后遗症[1]。

治疗药物监测(therapeutic drug monitoring,TDM)是应用现代分析技术测定患者体液中的药物及其代谢产物浓度,以优化设计或调整给药方案,以实现个体化治疗,提高疗效,减免毒副作用的药学技术方法[2]。TDM是近代临床药物治疗划时代的重大进展之一,也是结核化疗中的一个新的发展方向。血药浓度监测只是TDM的一个重要组成部分。本课题拟建立测定抗结核药物利福霉素在TBM患者脑脊液中浓度的方法并进行分析,制订合理的给药方案,以避免药物过量引起的不良反应及药物不足导致的治疗失败,也为今后其他项目(尿药浓度、痰药浓度、胸腹水药物浓度等)的TDM工作提供依据。

1仪器与材料

质谱仪:美国AB公司API3200LC-MS/MS质谱仪;液相色谱仪:日本岛津公司LC-20A型高效液相色谱仪,大气压化学电离源[3];流动相为醋酸铵(0.01 mol/L)-甲醇(10∶90),醋酸铵、甲醇为色谱纯,利福霉素鈉为标准品。

2方法与结果

2.1分析条件

2.1.1液相色谱条件 色谱柱:沃特世公司C18柱,标准:4.6 mm×100.0 mm,3.5 μm;流动相:0.01 mol/L的醋酸铵-甲醇(10∶90);流速:0.4 ml/min;柱温:室温。

2.1.2质谱条件 减簇电压(DP):95 V;碰撞室入口电压(CEP):20 V;Q1入口电压(EP):8.0 V;碰撞室出口电压(CXP):20 V;离子源电压(IS):5500 V;碰撞电压(CAD):8.0 V;离子源:APCI,ESI;扫描方式:正离子扫描;温度(TEM):500℃;气帘气(CUR):20 psi;GS1:50 psi;GS2:50 psi;MRM:719.9/688.2,CE:35 V;MRM:719.9/660.1,CE:40 V;MRM:719.9/295.0,CE:62 V[4-6]。

2.2溶液制备

2.2.1利福霉素钠标准储备液制备 称取利福霉素钠对照品0.010 03 g,置100 ml量瓶中,配制为100.3 μg/ml的溶液。

2.2.2利福霉素钠工作溶液制备 取利福霉素钠标准储备液, 置10 ml量瓶中,加甲醇-水(50∶50)溶液稀释至刻度,摇匀,得10.03 μg/ml的工作溶液。取10.03 μg/ml的利福霉素钠工作溶液1 ml置100 ml量瓶中,加甲醇-水(50∶50)溶液稀释至刻度,摇匀,得100.3 ng/ml的工作溶液。

2.3样品的来源和制备

2.3.1样品的来源 TBM患者脑脊液:2016年1~6月在内蒙古第四医院住院的TBM患者,住院期间行腰椎穿刺术取脑脊液。

2.3.2样品的制备 取患者脑脊液1 ml置15 ml塑料离心管中,精密加甲醇-水溶液(50∶50)4 ml,涡旋3 min,溶液经微孔滤膜(0.45 μm)过滤后,供液相色谱串联质谱仪测定[7]。

2.4 LC-MS/MS的条件

2.4.1 LC-MS/MS的条件选择 筛选不同的液相色谱柱及色谱、质谱条件[8-11],最后确定为“2.1”项下的液相色谱串联质谱条件检测利福霉素钠,应用“2.1”项下的色谱-质谱条件进行分析。

2.4.2标准曲线 取2 μg/ml的标准溶液,分别进样1、2、4、5、6、8、10 μl,用“2.1”项下的LC-MS/MS条件进行测定,得到定量离子对719.9/688.2的峰面积。以测定浓度(X,μg/ml)为横坐标与峰面积(Y,counts)为纵坐标进行线性回归分析,线性方程为Y=5.22e+004X-1.52e+003(r=0.9997)。结果见表1、图1,提示利福霉素钠在0.4~4.0 μg/ml范围内线性关系良好。

2.4.3检测限 将100 ng/ml的利福霉素钠工作溶液进样5 μl,得信噪比S/N=3.6,该方法的检出限为100 ng/ml。

2.4.4精密度试验 将利福霉素钠制成0.4 g/ml的标准溶液6份,分别通过“2.1”项下的方法检测,得到的峰面积分别为19 754、18 965、20 038、18 997、19 765、18 661(RSD=2.9%),方法精密度较好。

2.4.5稳定性试验 将0.8 μg/ml的利福霉素钠标准溶液分别于0、1、4、8、12、24 h分别进样5 μl。采用上述液相色谱串联质谱条件进行分析,得到峰面积分别为38 970、41 120、40 665、38 385、38 100、36 919(RSD=4.1%),显示利福霉素钠在24 h内稳定。

2.4.6实际样品的测定试验 以时间(min)为横坐标,以响应浓度(cps)为纵坐标,分别做阴性对照色谱图及利福霉素钠对照品色谱图,分别见图2、3,应用本方法测定6例不同TBM患者脑脊液中利福霉素钠的量分别为0.51、0.43、0.40、0.68、0.35、0.28 μg/ml。

3讨论

利福霉素为半合成的广谱抗菌素,它对分枝杆菌,特别是对结核菌有强力的抑菌作用。利福霉素行静脉注射或局部应用效果较好,口服几乎不能达到有效的血药浓度;药代动力学方面,单次静脉滴注利福霉素钠0.5、1.0、2.0 g后的血药峰浓度(Cmax)分别为28、46、90 mg/L,1 h后即下降至50%左右。每6小时静注利福霉素钠0.5 g,稳态血药浓度为36 mg/L。血浆蛋白结合率<5%。血液消除半衰期(t1/2)为3~5 h[12]。该药在脑脊液中的分布情况及浓度少见详细报道,希望通过该项研究,弥补脑脊液中利福平、利福霉素药物浓度测定的不足,为进一步研究血液、脑脊液中药物代谢情况提供技术支持[13]。

同时,利福霉素的杀菌能力与药物在病灶区域的浓度有密切关系,但其具有肝脏毒性、胃肠功能紊乱、神经系统症状、血小板减少症和变态反应等严重的毒副作用[14]。因此,本课题通过监测生物体液中药物的浓度,以达到最佳治疗效果,并尽量减少毒副作用,具有重要的临床意义。

液质联用技术在分析药物及其在各种复杂生物基质(全血、血浆、尿、胆汁及生物组织)中的代谢产物时,由于其选择性强、灵敏度高,不仅可以避免复杂、繁琐、耗时的样品前处理工作,而且能分离鉴定以往难于辨识的痕量药物代谢产物,尤其是串联质谱(MS/MS)的应用,通过多反应监测(MRM),可以大大提高分析的专一性,改善信噪比,提高灵敏度,从而快速、方便地解决问题[15]。

本研究采用液质联用的方法对TBM患者脑脊液中利福霉素进行检测,具有方法灵敏、准确、稳定性好等优点。脑脊液中药物浓度监测只是TDM中的一个重要组成部分。本课题通过建立结核药物监测的方法并进行药动学分析,以制订合理的给药方案,为今后其他药物治疗学监测工作提供依据。

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(收稿日期:2016-12-23 本文编辑:方菊花)

[基金项目]内蒙古自治区医疗卫生计生科研计划项目(2013 03027)

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