徐硕　徐文峰　金鹏飞

[摘要] 目的 应用高效液相色谱（HPLC）技术，建立同时测定复方褪黑激素片中维生素B6和褪黑激素含量的方法。 方法 采用Alltima C18色谱柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm），以50 mmol/L磷酸二氢铵溶液（磷酸调至pH 3.0）-乙腈为流动相，梯度洗脱，流速0.5 mL/min，检测波长278 nm，柱温30℃，进样体积10 μL，对复方褪黑激素片中的维生素B6和褪黑激素进行含量测定。结果 维生素B6和褪黑激素检测浓度分别在80.34～401.7 mg/L（r=0.9997）和8.50～42.5 mg/L（r=0.9999）范围内与峰面积呈良好的线性关系；精密度和稳定性良好，相对标准偏差（RSD）均<0.8%；回收率良好，维生素B6和褪黑激素的平均回收率（n=9）分别为100.4%和98.86%，RSD分别为0.42%和0.86%。复方褪黑激素片中维生素B6平均含量为14.14 mg/片，褪黑激素平均含量为0.9853 mg/片。 结论 该方法准确、简单、快速，可用于同时测定复方褪黑激素片中维生素B6和褪黑激素的含量。

[关键词] 维生素B6；褪黑激素；高效液相色谱；含量测定

[中图分类号] R927.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）01（c）-0142-05

[Abstract] Objective To develop a high performance liquid chromatography （HPLC） method for the simultaneous determination of vitamin B6 and melatonin in Compound Melatonin Tablets. Methods An Alltima C18 column （150 mm × 4.6 mm， 5 μm） was used for the separation， with gradient elution of 50 mmol/L ammonium dihydrogen phosphate （adjusted pH to 3.0 with H3PO4） and acetonitrile as the mobile phase at the flow rate of 0.5 mL/min. The detection wavelength was set at 278 nm. The column temperature was 30℃ and injection volume was 10 μL. Vitamin B6 and melatonin in Compound Melatonin Tablets were quantified by the established method. Results The liner range of vitamin B6 and melatonin was 80.34-401.7 mg/L （r=0.9997） and 8.50-42.5 mg/L （r=0.9999） respectively. The precision and stability were satisfactory， and the relative standard deviation （RSD） were less than 0.8%. The average recoveries （n=9） was 100.4% （RSD=0.42%） and 98.86% （RSD=0.86%） for vitamin B6 and melatonin respectively. The average contents of vitamin B6 and melatonin in Compound Melatonin Tablets were 14.14 mg/tablet and 0.9853 mg/tablet. Conclusion The established method is accurate， simple and rapid， and can be utilized for simultaneous determination of vitamin B6 and melatonin in Compound Melatonin Tablets.

[Key words] Vitamin B6； Melatonin； HPLC； Determination

褪黑激素（melatonin，MLT）化學名称为N-乙酰基-5-甲氧基色胺，主要是由哺乳动物和人类松果体产生、分泌的一种吲哚类物质[1-2]。褪黑激素是一种人体内分泌系统的调节剂，可将内源性生物节律的周期、位相调整到与环境周期同步，具有镇静、催眠、调节睡眠-觉醒、改善时差反应综合征的作用。在延续人体衰老和抵抗老年性疾病方面具有一定作用，某些肿瘤和神经系统疾病的发生、发展也与褪黑激素的独特昼夜排泌节律相关[1，3-6]。维生素B6对智力和体力的提高具有促进作用，能调节血液中的葡萄糖水平，维持甲状腺、肾上腺和性腺的正常功能，改善大脑物质的新陈代谢[7-9]。复方褪黑激素片是以高纯度的褪黑素、维生素B6为原料制成的具有改善睡眠作用的保健品，适用于失眠者、睡眠质量差、易惊醒者，片剂中加入维生素B6有助于提高免疫力。

随着生命科学研究的不断深入，人工合成褪黑激素的工艺已完成，该物质作为保健食品被广泛应用。保健品中有效成分的含量高低对于保证其质量稳定，发挥特定功能方面具有重要意义，因此对其进行含量测定是很有必要的。虽然已有报道，褪黑激素和维生素B6的含量测定方法[1-3，9-23]，但同时对这两种成分进行含量测定的研究还未见报道。褪黑激素与维生素B6的化学结构、理化性质和色谱行为差异大，因此实现同时分析的难度较大。文献报道的维生素B6含量测定方法使用离子对高效液相色谱法（HPLC）[9，13-23]，长期运行对色谱柱损害较大。

本研究应用HPLC技术，首次建立了同时测定保健品复方褪黑激素片中维生素B6和褪黑激素含量的方法，该方法准确、专属性强，避免了离子对试剂、液相系统的损害，样品制备操作简便，可用于其质量控制，具有一定参考价值。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260液相系统：配有G1311C四元梯度泵，G1329B自动进样器，G1316A柱温箱，G4212B DAD检测器（Agilent Technologies，美国）；Mettler XP-205电子天平（瑞士，梅特勒公司）；KQ-800KDE型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；Millipore超纯水处理系统。

1.2 试药

乙腈（色谱纯，美国Fisher公司，批号：157753）；磷酸（色谱纯，瑞士Fluka公司，批号：BCBB0522）；磷酸二氢铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：20130121）；甲醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：20150917）；实验用水为超纯水。维生素B6（盐酸吡多辛）对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100116-200502，纯度100%）；褪黑激素对照品（上海源叶生物科技有限公司，纯度98%）。复方褪黑激素片（规格：含维生素B6 12.2 mg/片，褪黑激素1 mg/片，批号：2067119、2057676和2049624，美国Natrol公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Alltima C18色谱柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：50 mmol/L磷酸二氢铵溶液（磷酸调至pH 3.0）（A）-乙腈（B），梯度洗脱（梯度变化程序见表1），流速：0.5 mL/min；检测波长：278 nm；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL。在上述色谱条件下，维生素B6和褪黑激素色谱峰的理论塔板数分别为15 773和255 960。进样前，所有溶液均用0.22 μm微孔滤膜滤过。见表1。

2.2 混合对照品溶液的制备

分别精密称取维生素B6对照品约200 mg、褪黑激素对照品约20 mg，置100 mL量瓶中，加入甲醇-水（15∶85）适量，超声使溶解，用甲醇-水（15∶85）稀释至刻度，摇匀，即为混合储备液。再精密量取混合储备液1、2、2.5、3、5 mL于25 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，获得维生素B6浓度约为80、160、200、240、400 mg/L，褪黑激素浓度约为8、16、20、24、40 mg/L混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取片剂20片，精密称定，研细，精密称取粉末适量（约相当于维生素B6 10 mg，褪黑激素1 mg），置于50 mL量瓶中，加入甲醇-水（10∶90）适量，超声30 min，加甲醇-水（10∶90）稀释至刻度，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜濾过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 阴性溶液的制备

依据保健品说明书提供的配方，配制不含维生素B6和褪黑激素的空白溶液，按“2.3”项下操作，制备阴性溶液。

2.5 专属性和系统适用性试验

分别对阴性溶液、混合对照品溶液和供试品溶液进样分析，考察样品中其他成分和辅料对定量的干扰。阴性溶液、混合对照品溶液和供试品溶液的色谱图显示：样品中其他成分和辅料不干扰维生素B6和褪黑激素的测定。维生素B6和褪黑激素的分离度良好，理论板数均> 15 000。结果见图1。

2.6 线性关系考察、检测限及定量限

分别精密吸取“2.2”项下各浓度对照品溶液10 μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以峰面积为纵坐标，浓度（mg/mL）为横坐标作标准曲线，得到回归方程和线性相关系数（r）。维生素：B6 Y=26 480X+180.52，r=0.9997，线性范围80.34～401.7 mg/L；褪黑激素：Y=27 590X+2.6193，r=0.9999，线性范围8.50～42.5 mg/L。

将对照品溶液逐级稀释后，以信噪比（S/N）约为3.0时的浓度为各成分的检测限（LOD），S/N约为10.0时的浓度为各成分的定量限（LOQ），测得维生素B6的LOD和LOQ分别为0.0086、0.026 mg/L，测得褪黑激素的LOD和LOQ分别为0.085、0.28 mg/L。

2.7 精密度试验

对批号为2067119的一份供试品溶液连续进样6次，计算得到维生素B6和褪黑激素色谱峰峰面积的RSD分别为0.021%和0.19%（n=6），表明仪器的精密度良好。

2.8 重复性试验

对批号2067119的样品独立制备供试品溶液6份，分别进样分析，计算得到维生素B6和褪黑激素含量的RSD分别为2.21%和1.52%（n=6），说明方法的重复性良好。

2.9 回收率试验

取空白基质约0.29 g，精密称定，再分别精密加入“2.2”项下混合储备液4、5、6 mL，按照“2.3”项下操作，制备各回收率溶液，进样测定。每个浓度制备3份，共9份样品。以实际测得量和理论加入量的比值作为回收率，计算回收率的RSD，结果见表2。表明方法回收率良好。

2.10 稳定性试验

对批号为2067119的供试品溶液分别于0、2、4、8、12、24 h进样分析，计算得到24 h内维生素B6和褪黑激素色谱峰峰面积的RSD分别为0.11%和0.76%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.11 样品测定

应用建立的方法对批号为2067119、2057676、2049624的复方保健品片进行含量测定，每个样品测定2份，取平均值。测定结果见表3。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

维生素B6的紫外谱图在218、256、292、326 nm处有最大吸收，褪黑激素的紫外谱图在198、224、278 nm处有最大吸收，褪黑激素在样品中含量较低，兼顾两种成分综合考虑，选择278 nm作为检测波长。

3.2 色谱条件的优化

维生素B6为水溶性维生素，极性大，在碱液中易破坏，在酸液中稳定，褪黑激素与维生素B6化学结构不相关，理化性质和色谱行为差异大，因此实现同时分析的难度较大。本实验考察了甲醇-水、甲醇-20 mmol/L磷酸二氢铵（磷酸调至pH 3.0）、甲醇-50 mmol/L磷酸二氢铵、甲醇-0.04%戊烷磺酸钠（用冰醋酸调至pH 3.0）、乙腈-10 mmol/L磷酸二氢铵（含0.01%庚烷磺酸钠）、乙腈-10 mmol/L磷酸二氢铵（含0.01%庚烷磺酸钠，用磷酸调至pH 3.0）、乙腈-50 mmol/L磷酸二氢铵、乙腈-50 mmol/L磷酸二氢铵（磷酸调至pH 3.0）作为流动相对维生素B6和褪黑激素色谱峰的影响。发现维生素B6峰形受流动相影响较大，色谱峰容易出现前延或拖尾，本实验通过比较多种流动相发现，以乙腈-50 mmol/L磷酸二氢铵（磷酸调至pH 3.0）为流动相时两种目标成分峰形均很好，对称因子为1.0，维生素B6和褪黑激素色谱峰的理论塔板数分别为15 773和255 960。目前国内外测定维生素B6文献报道大多需采用含有离子对试剂的流动相[9，13-23]，长期运行会对液相系统和色谱柱造成较大损害，而本研究使用的流动相不需离子对试剂，且通过比较发现，维生素B6色谱峰的对称性及理论塔板数更好。因两种成分极性差异较大，用等度条件难以同时洗脱出来。考察了不同梯度洗脱程序以及比较了不同流速（0.5、0.8、1.0 mL/min）的影响，在最终采用的色谱条件下两种成分的保留时间适宜，方便分析检测。

3.3 提取溶剂的选择

本研究比较了用甲醇-水（50∶50）、甲醇-水（20∶80）、甲醇-水（10∶90）作为提取溶剂对维生素B6和褪黑激素的影响。结果显示，褪黑激素的峰形和提取率无明显变化，而维生素B6的峰形受甲醇比例的影响较大，当甲醇比例超过10%时，其峰形不佳，褪黑激素很易溶于甲醇，加入少量甲醇即可将其从样品中提取完全，同时又能保证维生素B6的峰形较好，故最终选择以甲醇-水（10∶90）作为提取溶剂。

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（收稿日期：2016-09-26 本文编辑：李亚聪）