李 伟，封赞祥，刘宝辉，王 锋，钱兆洋，王玉玖

·论著·

雌激素-胶原蛋白海绵对移植静脉再狭窄的影响及机制研究

李 伟，封赞祥，刘宝辉，王 锋，钱兆洋，王玉玖*

背景 自体静脉行冠状动脉旁路移植术后，桥静脉再狭窄发生率高，影响远期疗效。目的 观察雌激素-胶原蛋白海绵在预防移植静脉再狭窄中的作用并探讨其可能机制。方法 2016年1—5月，选取雄性新西兰家兔80只,采用随机数字表法将家兔分为A～D共4组,各20只。建立颈外静脉-颈总动脉旁路移植动物模型，游离并取颈外静脉1.5 cm，将其两端倒置，分别与颈总动脉行端侧吻合。A组不进行特殊处理；B组采用胶原蛋白海绵敷于吻合口周围；C组以17β-雌二醇均匀涂抹于吻合口周围；D组将胶原蛋白海绵浸泡于17β-雌二醇溶液，然后敷于吻合口周围。分别于术后6 h及7、14、28 d各取5只家兔，完整取下桥静脉。每个标本选3个不同切面，计算机图像处理系统测量内膜、中膜厚度,采用Western blotting法检测增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(pERK1/2)表达水平。结果 C组、D组术后14、28 d桥静脉内膜厚度小于A组、B组，且D组术后14、28 d桥静脉内膜厚度小于C组(P<0.05)。C组、D组术后14、28 d桥静脉中膜厚度小于A组，C组术后28 d及D组术后14、28 d桥静脉中膜厚度小于B组，D组术后28 d桥静脉中膜厚度小于C组(P<0.05)。C组和D组术后6 h桥静脉PCNA表达水平低于A组、B组，C组术后7 d桥静脉PCNA表达水平低于A组、B组,D组术后7、14、28 d桥静脉PCNA表达水平低于A组、B组和C组(P<0.05)。C组、D组术后6 h桥静脉pERK1/2与ERK1/2比值低于A组、B组，C组术后7 d桥静脉pERK1/2与ERK1/2比值低于A组、B组，D组术后7、14、28 d桥静脉pERK1/2与ERK1/2比值均低于A组、B组和C组(P<0.05)。结论 雌激素用于自体移植静脉外膜可降低PCNA的表达水平和ERK1/2的活化，抑制细胞增殖和移植静脉内膜、中膜增生；胶原蛋白海绵具有缓释作用，提高了雌激素在局部的药物浓度，延长了药物的作用时间。

冠状动脉旁路移植术,非体外循环；雌激素类；胶原蛋白海绵；内皮细胞

李伟，封赞祥，刘宝辉，等.雌激素-胶原蛋白海绵对移植静脉再狭窄的影响及机制研究[J].中国全科医学，2017，20(2)：172-176.[www.chinagp.net]

LI W,FENG Z X,LIU B H,et al.Effect and influence of estrogen-collagen sponge on restenosis in autologous vein graft protein expression[J].Chinese General Practice，2017，20(2)：172-176.

冠状动脉旁路移植术(CABG)是目前外科治疗冠心病的经典手术，大隐静脉仍是最常用的桥血管，自体移植静脉再狭窄是影响手术远期疗效的主要因素[1-3]。雌激素在抑制血管平滑肌增殖的同时，可促进损伤血管的内皮化，预防CABG后再狭窄并促进血管重构[4-5]，但因其不良反应较大而限制了全身用药。本研究通过建立家兔颈外静脉-颈总动脉旁路移植模型，以胶原蛋白海绵为载体，制备具有缓释作用的雌激素-胶原蛋白海绵，探讨雌激素-胶原蛋白海绵对移植静脉血管再狭窄的影响及可能的作用机制，为降低冠心病患者CABG后移植静脉再狭窄风险提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 于2016年1—5月，选取雄性新西兰家兔80只,购于山东省济南市西岭角养殖繁育中心，批号SCXK(鲁)20150001，体质量2.5～3.0 kg,清洁级，颗粒饲料饲养,自由进食,光照12 h/d。采用随机数字表法将家兔分为A～D共4组,各20只。实验过程中对家兔的处置符合中国动物伦理学要求，并获得滨州医学院附属医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 材料与试剂 17β-雌二醇购自美国Sigma公司，增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞外调节蛋白激酶

本文创新性：

本研究首次尝试使用胶原蛋白海绵作为药物载体携载雌激素，结果证实胶原蛋白海绵具有缓释作用，不但可以提高药效，且可延长药物作用的时间，是具有应用前景的药物载体。同时，雌激素因全身不良反应限制了其广泛应用，通过胶原蛋白海绵携载局部应用，既减少了全身不良反应，又在局部发挥了抗血管狭窄的作用。本研究既为雌激素-胶原蛋白海绵用于临床提供了理论基础，也为胶原蛋白海绵作为药物载体提供了广阔的前景，具有巨大的借鉴价值。

1/2(ERK1/2)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(pERK1/2)等抗体购自美国Santa Cruz公司，四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸钠(SDS)、甘氨酸、组织蛋白提取液、甲叉丙烯酰胺等购自生工生物工程(上海)股份有限公司，医用胶原蛋白海绵购于无锡贝迪生物工程有限公司。

1.2.2 模型制备 以20%乌拉坦(5 ml/kg)耳缘静脉注射，家兔麻醉后固定于手术台上。沿颈部正中纵行切口，暴露并游离颈外静脉1.5 cm，动脉夹夹闭近心端和远心端，斜行切断并用肝素氯化钠溶液冲洗离体静脉，结扎颈外静脉断端。沿气管旁沟游离颈总动脉(注意勿损伤迷走神经)，长2.5 cm，沿颈总动脉做斜形切口，肝素氯化钠溶液冲洗。颈外静脉两端倒置，分别与颈总动脉行端侧吻合，于第二吻合口缝线打结前开放近心端动脉夹，放血排气后打结，并检查吻合口有无漏血，漏血处按压止血。A组不进行特殊处理；B组采用1 cm×2 cm胶原蛋白海绵敷于吻合口周围；C组以二甲基亚砜(DMSO)溶解17β-雌二醇30 mg，再加入0.9%氯化钠溶液配制成终浓度为0.01 mol/L的溶液，均匀涂抹于吻合口周围；D组将1 cm×2 cm胶原蛋白海绵浸泡于0.01 mol/L 的17β-雌二醇溶液，敷于吻合口周围。逐层缝合，待家兔苏醒后放于饲养室单笼饲养。术前耳缘静脉注射肝素(1.5 mg/kg)，术后3 d内每日肌肉注射青霉素(20万U/只)预防感染，并每日皮下注射肝素(1 mg/kg)预防血栓发生。手术结束后通过触摸远心端颈总动脉搏动观察血管再通情况。

1.2.3 取材 各组分别于术后6 h及7 d、14 d、28 d取5只家兔，经颈部原切口于气管食管沟内找到桥静脉，检查桥静脉是否通畅，完整取下桥静脉，并取对侧颈外静脉为对照。

1.2.4 常规组织化学染色 采用10%中性甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，连续切片。HE染色后显微镜下观察，每个标本选3个不同切面，采用计算机图像处理系统测量每一切面3、6、9、12点钟4个方向内膜、中膜厚度，取平均值。

1.2.5 PCNA、ERK1/2、pERK1/2表达水平检测 采用Western blotting技术检测PCNA、ERK1/2、pERK1/2表达水平。桥静脉剪碎后加入蛋白裂解液(1 ml/250 mg)，组织匀浆器30 s低速匀浆，每次匀浆间隔冰浴1 min，至组织完全裂解。于4 ℃条件下，以10 000×g离心5 min,收集上清液，即为所提组织总蛋白。NanoDrop2000测定蛋白浓度后分装，保存于-80 ℃低温冰箱。每一泳道加入等量蛋白样品，聚丙烯酰胺凝胶电泳，并以湿转法将蛋白转移至硝酸纤维膜上，5%脱脂奶粉封闭。加PCNA、ERK1/2、pERK1/2一抗(以1∶1 000比例稀释)4 ℃孵育过夜，TBS清洗，加二抗(1∶1 000比例稀释)37 ℃孵育2 h。增强化学发光(ECL)试剂显影，凝胶成像分析系统照相并分析条带强度，记录PCNA、ERK1/2、pERK1/2表达水平，并计算pERK1/2与ERK1/2比值。

2 结果

2.1 桥静脉内膜、中膜厚度 各组术后6h和7d桥静脉内膜、中膜厚度比较，差异无统计学意义(P>0.05)。各组术后14d、28d桥静脉内膜厚度比较，差异有统计学意义(P<0.05),其中，C组、D组术后14、28d桥静脉内膜厚度小于A组、B组，且D组术后14、28d桥静脉内膜厚度小于C组，差异有统计学意义(P<0.05)。各组术后14、28d桥静脉中膜厚度比较，差异有统计学意义(P<0.05),其中，C组、D组术后14、28d桥静脉中膜厚度小于A组，C组术后28d及D组术后14、28d桥静脉中膜厚度小于B组，D组术后28d桥静脉中膜厚度小于C组，差异有统计学意义(P<0.05,见表1)。

2.2PCNA表达水平 各组术后6h及7、14、28d桥静脉PCNA表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05),其中，C组和D组术后6h桥静脉PCNA表达水平低于A组、B组，C组术后7d桥静脉PCNA表达水平低于A组、B组,D组术后7、14、28d桥静脉PCNA表达水平低于A组、B组和C组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

表1 各组术后各时间点桥静脉内膜和中膜厚度比较±s，μm)

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05；与C组比较，cP<0.05

Table2ComparisonofthePCNAexpressionlevelofbridgingveinsatdifferenttimepointsamongeachgroup

组别只数术后6h术后7d术后14d术后28dA组5128±016088±004081±012086±011B组5123±013084±007081±007084±011C组5095±018ab060±009ab068±008069±010D组5095±012ab036±011abc040±008abc025±007abcF值4458270821376024676P值0040<00010002<0001

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05；与C组比较，cP<0.05

2.3 pERK1/2与ERK1/2比值 各组术后6 h及7、14、28 d桥静脉pERK1/2与ERK1/2比值比较，差异有统计学意义(P<0.05)，其中，C组、D组术后6 h桥静脉pERK1/2与ERK1/2比值低于A组、B组，C组术后7 d桥静脉pERK1/2与ERK1/2比值低于A组、B组，D组术后7、14、28 d桥静脉pERK1/2与ERK1/2比值均低于A组、B组和C组，差异有统计学意义(P<0.05，见表3)。

Table3ComparisonofpERK1/2toERK1/2ratioofbridgingveinsatdifferenttimepointsamongeachgroup

组别只数术后6h术后7d术后14d术后28dA组5085±011059±004057±005048±007B组5081±013059±005051±076051±006C组5061±007ab051±003ab046±006042±009D组5051±006ab037±003abc038±005abc026±005abcF值82922400645367626P值0008<000100390010

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05；与C组比较，cP<0.05

3 讨论

CABG通常将自体大隐静脉作为静脉桥材料，然而，约20%的CABG后患者在1年内发生移植静脉再狭窄甚至闭塞，术后10年通畅率仅约50%，因此，自体移植静脉再狭窄成为心脏外科医生面临的难题[6]。静脉移植术后的病理过程包括早期继发性血栓形成期(术后1～5 d)、亚急性期(6～14 d)和血管重塑期。术后血流动力学改变引起血管壁内皮细胞损伤，血管收缩，血小板聚集、黏附，进而激活凝血系统导致继发性血栓的形成。因此术中和术后的抗凝处理是预防继发性血栓形成的关键措施[7-8]。本研究术中对桥静脉和吻合口进行冲洗并肝素化处理，术后肝素抗凝可降低早期血栓发生风险。亚急性期由于内皮细胞损伤，静脉中膜平滑肌失去抑制而大量增殖，向内膜迁移，并合成大量的细胞外基质，使新内膜管壁增厚以适应动脉内的高压环境。血管重塑期移植静脉受高机械压力冲击，强烈刺激血管平滑肌细胞，蛋白合成分泌增加，细胞增殖和内膜增生，血管壁重构可致再狭窄。目前普遍认为，中膜平滑肌细胞增殖是移植静脉再狭窄的关键因素[8-9]。

雌激素可通过促进损伤内皮细胞修复，抑制血管平滑肌细胞增殖和血管壁负性重塑等多重机制防止移植静脉再狭窄。雌激素可抑制内皮细胞凋亡，促进内皮细胞的增殖和迁移，加速损伤内皮的修复过程，刺激受损血管内皮化[4-5]；在体外，雌激素可抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移[10]。本研究结果显示，损伤局部涂抹雌激素有效减轻了术后血管内皮的损伤，促进内皮细胞的修复，并在一定程度上减轻了内膜、中膜增厚，雌激素-胶原蛋白海绵处理桥静脉可抑制内膜、中膜增厚，促进血管内皮修复。

PCNA表达水平与细胞DNA合成关系密切，在细胞增殖的启动上发挥重要作用，是反映细胞增殖状态的良好标志物。本研究采用PCNA表达水平反映细胞增殖的情况，结果显示，应用雌激素或雌激素-胶原蛋白海绵可降低PCNA表达水平，雌激素与雌激素-胶原蛋白海绵干预术后6 h PCNA表达水平无差异，雌激素-胶原蛋白海绵干预术后7 d PCNA表达水平低于雌激素干预，说明单纯局部应用雌激素在术后早期有抑制细胞增殖的作用，但药效持续时间短，难以维持。胶原蛋白海绵组织相容性好，可在体内完全降解，在外科手术中被广泛用于止血、刺激肉芽组织生长、促进创口愈合，且因其海绵样网状结构，携载药物时可限制药物的流失，使药物在局部停留足够的时间，取得持续稳定的给药效果[11]。为提高并延长雌激素的局部作用，本研究以胶原蛋白海绵为载体，发现胶原蛋白海绵携载雌激素与单纯应用雌激素相比，前者抑制细胞增殖和内膜、中膜增生的作用更强，药效更持久，可有效降低术后移植静脉狭窄风险。

ERK是促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的枢纽，是介导细胞增殖的重要途径。使用抑制剂U0126抑制ERK激活，可减轻移植血管内膜的增生，说明ERK参与了移植静脉再狭窄的形成过程[12]。有研究表明，雌二醇呈剂量依赖性地抑制大鼠主动脉平滑肌细胞增殖及MAPK激酶(MEK)、ERK活性，提示雌激素抗大鼠主动脉血管平滑肌细胞增殖作用可能与抑制MEK/ERK促有丝分裂途径有关[13]。动物体内实验也证实，雌二醇洗脱支架减轻内膜增生的作用可能与其抑制ERK1/2活化有关[14]。本研究采用pERK1/2与ERK1/2比值反映ERK磷酸化激活程度，结果显示，雌激素可抑制ERK1/2的激活水平，提示雌激素可能通过抑制ERK1/2磷酸化减轻血管内膜、中膜的增生，防止移植静脉再狭窄。

综上所述，本研究证实，雌激素用于自体移植静脉外膜可降低PCNA的表达水平和ERK1/2的活化，抑制细胞增殖和移植静脉内膜、中膜增生，从而预防早期移植静脉再狭窄的风险；胶原蛋白海绵具有缓释作用，提高了雌激素在局部的药物浓度，延长了药物的作用时间，是一种安全、理想、稳定的药物载体。本实验仅观察到术后28 d的血管变化情况，雌激素-胶原蛋白海绵对血管狭窄的远期防治效果有待进一步观察。

作者贡献：李伟、王玉玖负责课题设计与实施、资料收集整理、成文并对文章负责；封赞祥、刘宝辉、王锋、钱兆洋参与课题设计与实施、评估、资料收集整理；王玉玖进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

[1]DEB S,WIJEYSUNDERA H C,KO D T,et al.Coronary artery bypass graft surgery vs percutaneous interventions in coronary revascularization：a systematic review[J].JAMA,2013，310(19)：2086-2095.

[2]FANARI Z,WEISS S A,ZHANG W,et al.Meta-analysis of three randomized controlled trials comparing coronary artery bypass grafting with percutaneous coronary intervention using drug-eluting stenting in patients with diabetes[J].Interact Cardiovasc Thorac Surg,2014,19(6)：1002-1007.

[3]YAMASAKI M,DEB S,TSUBOTA H,et al.Comparison of radial artery and saphenous vein graft stenosis more than 5 years after coronary artery bypass grafting[J].Ann Thorac Surg,2016,102(3)：712-719.

[4]ZHENG S,CHEN X,HONG S,et al.17β-Estradiol inhibits vascular smooth muscle cell migration via up-regulation of striatin protein[J].Gynecol Endocrinol，2015,31(8)：618-624.

[5]LI H,CHENG Y,SIMONCINI T,et al.17β-Estradiol inhibits TNF-α-induced proliferation and migration of vascular smooth muscle cells via suppression of TRAIL[J].Gynecol Endocrinol,2016,32(7)：581-586.

[6]OWENS C D.Adaptive changes in autogenous vein grafts for arterial reconstruction：clinical implication[J].J Vasc Surg,2010,51(3)：736-746.

[7]GÖKAY S,CIÇEK D.Saphenous vein graft disease：causes,prevention,and contemporary treatment strategies[J].Turk Kardiyol Dern Ars，2012，40(8)：736-743.

[8]HARSKAMP R E,LOPES R D,BAISDEN C E,et al.Saphenous vein graft failure after coronary artery bypass surgery：pathophysiology,management,and future directions[J].Ann Surg，2013,257(5)：824-833.

[9]HOFFMANN R,NITENDO G,DESERNO V,et al.Follow-up results after interventional treatment of infarct-related saphenous vein graft occlusion[J].Coron Artery Dis,2010,21(2)：61-64.

[10]刘海梅,林桂平,徐进文，等.Caveolin-1蛋白及ERK1/2信号转导途径在17β-雌二醇抑制血管平滑肌细胞增殖中的作用[J].中国病理生理杂志,2009,25(11)：2093-2098. LIU H M，LIN G P，XU J W，et al.Effect of caveolin -1 and ERK1/2 on 17β-estradiol -induced inhibition of VSMC proliferation[J].Chinese Journal of Pathophysiology,2009,25(11)：2093-2098.

[11]蔡敏倩,王晓杰,李校堃.胶原蛋白海绵的性质及其临床应用[J].中国组织工程研究，2011,12(15)：2270-2274. CAI M Q，WANG X J，LI X K.Properties and clinical application of collagen sponge[J].Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research，2011,12(15)：2270-2274.

[12]焦学飞,高涌.ERK1/2在移植静脉再狭窄中的作用[J].蚌埠医学院学报，2011,35(11)：1084-1087. JIAO X F,GAO Y.Role of ERK-1/2 in restenosis of vein grafts[J].Journal of Bengbu Medical College，2011,35(11)：1084-1087.

[13]徐利,张心武,庞晓明,等.17β-雌二醇对大鼠血管平滑肌细胞C反应蛋白及其mRNA表达的影响[J].浙江大学学报(医学版),2013,42(1)：86-91. XU L,ZHANG X W,PANG X M,et al.Effects of 17β-estrogen on expressions of C-reactive protein and its mRNA of vascular smooth muscle cells in rats[J].Journal of Zhejiang University(Medical Sciences),2013,42(1)：86-91.

[14]LEEN L L,FILIPE C,BILLON A,et al.Estrogen-stimulated endothelial repair requires osteopontin[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2008,28(12)：2131-2136.

(本文编辑：吴立波)

Effect and Influence of Estrogen-collagen Sponge on Restenosis in Autologous Vein Graft Protein Expression

LIWei,FENGZan-xiang,LIUBao-hui,WANGFeng,QIANZhao-yang,WANGYu-jiu*

DepartmentofCardiovascularSurgery,BinzhouMedicalUniversityHospital,Binzhou256602,China

*Correspondingauthor：WANGYu-jiu,Chiefphysician;E-mail：yujiuwang@126.com

Background After coronary artery bypass grafting in autologous veins,the high incidence rate of restenosis in bridging veins will influence forward curative effects.Objective To observe the effect of estrogen-collagen sponge on preventing vein from restenosis in graft and explore its possible underlying mechanism.Methods From January to May in 2016，eighty male New Zealand rabbits were selected and randomly divided into A,B,C and D group by random number table method,20 rabbits each group.The external jugular vein-common carotid artery bypass transplantable animal model was established,freed and the 1.5 cm of the external jugular vein was taken,and then ends were inverted and was connected to common carotid artery by end-to-side anastomosis respectively.No special processing was made to A group;collagen sponge was applied to anastomotic stoma peripheries in B group,17β-estradiol was evenly applied to anastomotic stoma peripheries in C group;and in D group,collagen sponge was steeped in 17β-estradiol solution and applied it to anastomotic stoma peripheries.Five rabbits were got at time points of 6 hours,7 days,14 days and 28 days after operation respectively,and the bridging veins were completely removed.Three different sections were selected from each specimen sample.Computer image processing system was used to measure intima and media thickness,and Western blotting was adopted to detect the expression level of proliferating cell nuclear antigen(PCNA),ERK1/2 and pERK1/2.Results Fourteen days and twenty-eight days after operation,the intimal thickness of bridging veins in group C and D were significantly less than that in group A and B,and the intimal thickness of bridging veins in group D was less than that in group C(P<0.05).Fourteen days and twenty-eight days after operation,the medial thickness of bridging veins in group C and D were significantly less than that in group A,the medial thickness of bridging veins in group C 28 days after operation and group D 14 days and 28 days after operation were significantly less than that in group B,and the medial thickness of bridging veins in group D 28 days after operation were significantly less than that in group C(P<0.05).The PCNA expression level of bridging veins in group C and D six hours after operation was significantly lower than that in group A and B,the PCNA expression level of bridging veins in group C seven days after operation was significantly lower than that in group A and B,the PCNA expression level of bridging veins in group D seven days,14 days and 28 days after operation was significantly lower than that in group A,B and C(P<0.05).The ratio of pERK1/2 to ERK1/2 of bridging veins in group C and D six hours after operation was lower than that in group A and B,the ratio of pERK1/2 to ERK1/2 of bridging veins in group C seven days after operation was lower than that in group A and B,and the ratio of pERK1/2 to ERK1/2 of bridging veins in group D seven days,14 days and 28 days after operation was lower than that in group A,B and C.Conclusion The estrogen in vein membrane of autologous graft can decrease the expression level of PCNA and the activation of ERK1/2,and suppress the proliferation of cells and thickness of intima and media of vein grafts.The collagen sponge with sustained release effect increases the local drug concentration of estrogens and prolongs the acting time of drugs.

Coronary artery bypass,off-pump;Estrogens;Collagen sponge;Endothelial cells

山东省自然科学基金资助项目(ZR2012HL17)；山东省高等学校科技计划项目(J12LM66)

R 654.3

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.02.010

2016-07-25；

2016-11-20)

256602山东省滨州市，滨州医学院附属医院心脏外科

*通信作者：王玉玖，主任医师；E-mail：yujiuwang@126.com