周颖方婉仙吴英松

·论著·

促黄体生成素定量测定试剂盒（化学发光免疫分析法）的临床性能评价

周颖1方婉仙2吴英松3★

目的对广州市达瑞生物技术股份有限公司的促黄体生成素定量测定试剂盒（化学发光免疫分析法）进行临床应用研究及临床性能评价。方法采用平行、盲法、对照试验设计，用达瑞生物公司试剂盒检测335例样本，以雅培公司的促黄体生成素测定试剂盒（化学发光微粒子免疫检测法）作为对照试剂盒，罗氏公司的促黄体生成素检测试剂盒（电化学发光法）作为复核试剂盒。操作按各试剂盒说明书进行，对达瑞生物公司试剂盒的符合率和相关性进行计算分析。结果同雅培公司试剂盒比较，达瑞生物公司试剂盒检测血清样品异常符合率为95.8％，正常符合率为95.2％，总符合率为95.4％，Kappa值为0.898（P＜0.01）。线性回归方程为Y=0.358+0.961X，两者测定值接近，相关系数为0.988（P＜0.01），相关性良好。同血清检测结果相比，血浆检测结果Kappa值为1.000（P＜0.01），线性回归方程为Y=0.120+0.966X，相关系数r值为0.999（P＜0.01），相关性良好。特异性样本检测结果均为正常。结论本试剂盒检测性能可以满足临床应用的需要。

促黄体生成素（LH）；化学发光免疫分析法（CLIA）；试剂盒

近年来，不孕症的发病率持续增高，给育龄人群带来很大的困扰。在美国，大约16.6％年龄介于15岁至44岁的女性患有不孕不育症，11.9％（730万）女性需要生育治疗［1-3］。国内不孕症的发病率增高至7％～10％［4-7］。内源性黄体生成素的缺乏是导致自然周期排卵障碍的主要原因［8］，其分泌主要受促黄体生成素的调节。促黄体生成素（luteinizing hormone，LH）是一种糖蛋白激素，由腺垂体嗜碱粒细胞分泌，能够协同促卵泡激素共同作用维持卵巢的月经周期，导致排卵与黄体形成。异常的促黄体生成素水平以及由此导致的促卵泡激素、雌激素、孕酮、睾丸激素等水平的增高或者降低与许多疾病有关联。促黄体生成素水平增高在女性中会引起绝经、原发性卵巢功能低减以及多囊卵巢疾病，在男性中则会引起原发性性腺功能衰减。而促黄体生成素水平降低在女性中会引起原发性卵巢功能亢进，在男性中会引起原发性性腺功能亢进。目前，市面上以雅培公司的促黄体生成素测定试剂盒（化学发光微粒子免疫检测法）和罗氏公司的促黄体生成素检测试剂盒（电化学发光法）较为常用。但进口试剂盒存在价钱昂贵、检测系统封闭等不足之处。近年来，发光免疫分析方法因其具有灵敏度高、线性范围宽、操作简单及容易实现自动化等特点［9-10］，受到广大科研工作者和临床分析工作者的注意，该技术将在现在及未来的免疫分析检测领域显示极其重要的作用。因此，开发操作简单、经济和性能较优的国产促黄体生成素化学发光法测定试剂盒具有巨大的社会价值和经济效益。

本文对广州市达瑞生物技术股份有限公司自行研制的促黄体生成素定量测定试剂盒（化学发光免疫分析法）进行了临床性能评价，与现行使用的进口试剂盒在样本检测中的符合率和相关性等指标进行比较分析，为LH体外诊断试剂盒的国产化开发应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

广州市达瑞生物技术股份公司的促黄体生成素定量测定试剂盒（化学发光免疫分析法）；促黄体生成素测定试剂盒（化学发光微粒子免疫检测法）（雅培公司，美国）；促黄体生成素检测试剂盒（电化学发光法）（罗氏公司，德国）。

1.1.2 LH质控品

C1预期浓度范围为4～6 IU/L，C2为32～48 IU/ L，C3为72～96 IU/L，广州市达瑞生物技术股份有限公司自配。

1.1.3 样本

随机选取年龄段为18岁至50岁人群血液样本。①血清样本：男性64例，绝经期女性28例，卵泡期女性63例，月经中期女性64例，黄体期女性64例，共283例；②血浆样本：，男性15例，女性37例，共52例，血浆样本随机来源个体相应的血清样本包含在上述283例血清样本中；③特异性样本：含促卵泡激素（follicle stimulating hormone，FSH）样本10例、含促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）样本10例、含人绒毛膜促性腺激素（human cho⁃rionic gonadotropin，HCG）样本10例、含类风湿因子（rheumatoid factor，RF）样本10例、含抗核抗体（anti nuclear antibodies，ANA）样本10例、含人抗鼠抗体（human anti mouse antibody，HAMA）样本10例、溶血样本10例、脂血样本10例、黄疸样本10例。以上样本分别由南方医科大学附属南方医院和厦门大学附属第一医院共2家医院提供，均用雅培公司的促黄体生成素测定试剂盒作为对照进行血清LH测定。

1.1.4 实验仪器

全自动化学发光免疫分析仪（型号：Ca⁃ris200），厦门优迈科医学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 实验设计

将采集的样本病例编码，采用盲法、对照试验设计，按各试剂盒说明书进行实验操作，用达瑞生物公司的试剂盒检测样本，美国雅培公司的促黄体生成素化学发光法测定试剂盒作为对照实验，差异样本用德国罗氏公司的促黄体生成素电化学发光法检测试剂盒作为复核实验。

1.2.2 样本正常参考值

达瑞生物公司试剂盒正常范围值：黄体期样本：0.78～13.2 IU/L；卵泡期样本：2.0～12.45 IU/L；月经中期样本：9.24～93.77 IU/L；男性样本：0.54～13.10 IU/L；绝经期样本：7.7～58.5 IU/L。

雅培试剂盒正常值范围：黄体期样本：0.56～14.00 IU/L；卵泡期样本：1.80～11.78 IU/L；月经中期样本：7.59～89.08 IU/L；男性：0.57～12.07 IU/L；绝经期样本：5.16～61.99 IU/L。

罗氏试剂盒正常值范围：黄体期样本：1.0～11.4 IU/L，卵泡期样本：2.4～12.6 IU/L；月经中期样本：14.0～95.6 IU/L；男性样本：1.7～8.6 IU/L；绝经期样本：7.7～58.5 IU/L。

1.2.2 统计处理

利用SPSS 13.0统计软件进行一致性及相关性分析，用Medcalc软件进行Bland⁃Altman定量分析。

2 结果

2.1 血清样本的检测结果分析

2.1.1 一致性性分析

与雅培公司试剂盒比较，达瑞生物公司试剂盒检测283例血清样本的异常符合率为95.8％，正常符合率为95.2％，总符合率为95.4％，Kappa值为0.898（P＜0.01）（表1）。

表1 临床检测血清统计归纳表Table 1Statistical table of clinical detection of serum

2.1.2 相关性分析

对达瑞生物公司试剂盒和对照试剂盒的临床检测结果相关性分析，其线性回归方程为Y=0.358+ 0.961X，相关系数r值为0.988(P＜0.01)（图1）。

2.1.3 Bland⁃Altman分析

达瑞生物公司试剂盒与对照试剂盒测值的95％一致性界限为（-5.4，5.8），4.24％（12/283）的点在95％一致性界限以外，可见达瑞生物公司试剂盒与对照试剂盒具有较高的一致性。

2.1.4 差异样本分析

按照各医院设定的正常参考值及达瑞生物公司试剂盒推荐的正常参考值，283例考核样本中，达瑞生物公司试剂盒和对照试剂盒对13例样本检测结果判断不一致，故对这13例差异样本用罗氏复核试剂盒进行检测。13例差异样本均在cut⁃off值附近，复核结果是有10例复核结果与考核结果一致，有3例复核结果与对照结果一致。

图1 血样测值相关性分析散点图Figure 1Scatterplot of correlation analysis of blood measurements

图22 种试剂盒检测促黄体生成素的Bland⁃Altman分析Figure 2Bland⁃Altman analysis of 2 kit which detect LH

2.2 血清与血浆样本的测值对比

本次临床试验对52例同一个体的血清和血浆样本用达瑞生物公司核试剂盒进行检测，结果52例样本判定结果一致（表3）。与血清检测结果相比，血浆的检测结果Kappa值为1.00（P＜0.01），线性回归方程为Y=0.120+0.966X，相关系数r值为0.999（P＜0.01）（图3）。

2.3 特异性样本试验分析

本次临床试验共纳入了90例特异性样本，分别为促卵泡生成激素（FSH）10例、促甲状腺激素（TSH）10例、人绒毛膜促性腺激素（HCG）10例、类风湿因子（RF）10例、抗核抗体（ANA）10例、人抗鼠抗体（HAMA）10例、溶血10例、脂血10例、黄疸10例，均使用达瑞生物公司试剂盒与对照试剂盒进行检测，两者检测结果均正常。

2.4 可靠性分析

本实验在对质控验证后方进行测试，质控结果表明标准差及浓度测值均符合质控标准要求，实验准确可靠。

表2 差异样本复核实验结果Table 2Results of re⁃experiment in differences samples

表3 同一病例血清血浆对比表Table 3Comparison of serum and plasma level of the same case

3 讨论

图3 血浆与对应血清测值相关性分析散点图Figure 3Correlation scatter plot of plasma and the corresponding measuring serum value

在男性和女性体内，由正、负反馈机制对促黄体生成素稳态进行调节，调节过程涉及到下丘脑、垂体、生殖器官、以及垂体和类固醇激素。促黄体生成素和其他垂体促性腺激素，卵泡刺激素在维护男性和女性的生殖系统的正常功能方面都发挥着非常重要的作用。一旦稳态失衡可导致各种疾病的发生，因此，检测促黄体生成素体内含量，对疾病诊断、预防及治疗都有重要的意义［11⁃12］。

化学发光免疫分析法是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与化学发光作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术［13⁃14］，其具有灵敏度高、线性范围宽、操作简单及容易实现自动化等特点，受到广大科研工作者和临床分析工作者的注意，显示了该技术将在现在及未来的免疫分析检测领域极其重要的作用。本研究中达瑞生物公司的促黄体生成素定量测定试剂盒（化学发光免疫分析法）是采用双抗体夹心免疫分析方法，利用化学发光磁微球免疫技术，定量测定人血清或血浆中的LH含量，试剂盒采用吖啶盐化合物作为标记物，无放射性污染，不会造成对环境的危害15］。

本研究以美国雅培公司的促黄体生成素测定试剂盒（化学发光微粒子免疫检测法）作为对照试剂盒，对自行研发的试剂盒进行临床检测性能评价。一致性分析结果和Bland⁃Altman分析结果表明达瑞生物公司试剂盒与美国雅培试剂盒两种测量方法结果具有较好的一致性，两种方法在临床上可以互相代替使用。但可能由于差异样本的LH测值在正常参考值的临界值附近，导致了有些样品不同试剂盒判断结果的不一致，故需要多次重复测定或进行第三方检测并作临床追踪检测，才可明确真实的实验结果和临床意义，用达瑞生物公司试剂盒和复核试剂盒进行差异样本分析，由于样本数较少，故与美国雅培试剂盒检测比较，达瑞生物公司试剂盒检测结果是否更为准确可靠还需进一步深入研究。本实验发现达瑞生物公司试剂盒对血清和血浆的检测结果一致性好，可适用于血清及血浆样本的检测，而且特异性样品实验分析结果表明达瑞生物公司试剂盒检测血样时不受促卵泡生成激素、促甲状腺激素、人绒毛膜促性腺激素、类风湿因子、抗核抗体、人抗鼠抗体、溶血、脂血、黄疸的干扰，特异性较好。综上所述，达瑞生物公司试剂盒与目前临床广为应用的进口试剂盒在指标检测性能上具有很好的等效性，可替代国外昂贵试剂应用于临床检测和基础医学的研究。

［1］李蓉，乔杰.助孕技术在输卵管性不孕的应用和评价［J］.实用妇产科杂志，2011，27（8）：570⁃572.

［2］Stefano P，Susanna S，Karen G，et al.Pregnancy com⁃plications in spontaneous and assisted conceptions of women with infertility and subfertility factors.A com⁃prehensive review［J］.Reproductive BioMedicine On⁃line，2016，8（7）：1472⁃1483.

［3］Rachel T，Gisele C，Lilian A，et al.Socioeconomic profile of couples seeking the public healthcare system（SUS）for infertility treatment［J］.JBRA Assisted Re⁃production，2016，20（3）：112⁃117.

［4］Chandra A，Martinez GM，Mosher WD，et al.Fertili⁃ty，family planning，and reproductive health：Data from the 2002 National Survey of Family Growth［J］. Vital Health Statistics，2005，23（25）：1⁃160.

［5］Mascarenhas NM，Flaxman SR，Boerma T，et al.Na⁃tional，regional，and global trends in infertility preva⁃lence since 1990：a systematic analysis of 277 health survey［J］.Ophthalmology，2012，120（12）：2377⁃2384.

［6］Chachamovich JR，Chachamovich E，Ezer H，et al. Investigating quality of life and health⁃related quality of life in infertility：a systematic review［J］.J Psycho⁃som Obstet Gynaecol，2010，31（2）：101⁃110.

［7］Sunderam S，Kissin DM，Crawford SB，et al.Assist⁃ed reproductive technology surveillance⁃united states，2013［J］.MMWR Surveill Summ，2015，64（11）：1⁃25.

［8］方玉，陈洁瑛，陈红.不孕症妇女自然周期过早内源性黄体生成素峰的发生与排卵障碍的相关性研究［J］.中国全科医学，2015，18（2）：162⁃165.

［9］陈海斌.化学发光免疫分析技术及其进展［J］.中国医学装备，2011，8（5）：56⁃59.

［10］Gao Y，Liu X，Qi W，et al.Highly efficient quench⁃ing of tris（2，2'⁃bipyridyl）ruthenium（ii）electrochemi⁃luminescence by ozone using formaldehyde，methylg⁃lyoxal，and glyoxalate as co⁃reactants and its applica⁃tion to ozone sensing［J］.Analyst，2015，140（12）：3996⁃4000.

［11］Begum N，Anwary SA，Alfazzaman M，et al.Role of serum follicle stimulating hormone，luteinizing hor⁃mone，testosterone and prolactin levels in azoospermic male partner of subfertile couple［J］.Mymensingh Med J，2016，25（2）：303⁃307.

［12］Anwary SA，Fatima P，Alfazzaman M，et al.Serum prolactin level of subfertile women［J］.Mymensingh Med J，2016，25（1）：91⁃95.

［13］汪晨，吴洁，宗晨，等.化学发光免疫分析方法与应用进展［J］.分析化学，2012，40（1）：3⁃10.

［14］金茂俊，邵华，金芬，等.化学发光免疫分析方法的研究及应用［J］.农产品质量与安全，2012，2：42⁃46.

［15］陆龙飞，葛胜祥，张军.化学发光免疫分析法研究进展［J］.分子诊断与治疗杂志，2015，7（5）：289⁃295.

Clinical research of luteinizing hormone(LH)quantitative diagnostic kit by chemiluminescent immunoassay(CLIA)

ZHOU Ying1,FANG Wanxian2,WU Yingsong3★
(1.Guangzhou Center for Disease Control and Prevention,Guangzhou,Guangdong,China,510440;2. Guangzhou Darui Biotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou,Guangdong,China,510663;3.Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong,China,510515)

ObjectiveTo investigate the clinical value of the new Luteinizing Hormone Quantitative Diagnostic Kit by Chemiluminescent Immunoassay(LH⁃CLIA kit)produced by Darui Biotechnology Co.,Ltd. for detection of LH by CLIA.MethodsIn a double blind controlled trial,the Darui LH⁃CLIA kit was compared against the Abbot LH⁃CLIA kit by measuring the LH levels of 335 serum samples.With LH⁃CLIA kit produced by Abbott(Chemiluminescence particles immunoassays)as a control,and with LH⁃CLIA kit produced by Roche(electrochemical luminescence method)as an inspection test.According to the kit instructions to operate,to calculate and analysis the coincidence rate and correlation of LH⁃CLIA kit produced by Darui Biotechnology Co.,Ltd.ResultsCompared with the Abbott LH⁃CMIA kit,the abnormal coincidence rate was 95.8％,and the normal coincidence rate was 95.2％,the total coincidence rate was 95.4％,the Kappa value was 0.898(P＜0.01).The analysis of quantitative determination indicated that measured serum sample value by Darui LH⁃CLIA kit is close to Abbott LH⁃CMIA kit.The linear regression equation was Y=0.358+0.961X,the correlation coefficient was 0.988(P＜0.01),which showed good correlation.Compared with the serums,the Kappa value of the plasmas was 1.000(P＜0.01),the correlation coefficient was 0.999(P＜0.01),the linearregression equation was Y=0.120+0.966X.The specificity samples test result was normal.Conclusion Darui LH⁃CLIA Kit is a valuable diagnostic kit for clinic application.

Luteinizing hormone(LH);Chemiluminescent immunoassay(CLIA);Kit

国家高技术研究发展计划（863计划）（2011AA02A101）

1.广州市疾病预防控制中心，广东，广州510440 2.广州市达瑞生物技术股份有限公司，广东，广州510663 3.南方医科大学，广东，广州510515

★通讯作者：吴英松，E⁃mail：wg@smu.edu.cn