黄柳炎刘崇梅毛敏邹亚阳娟张雪纯

·论著·

DNA定量分析联合液基细胞学检测对恶性腹腔积液的诊断价值

黄柳炎1刘崇梅2★毛敏2邹亚2阳娟1张雪纯1

目的探讨DNA定量分析和液基细胞学检测对恶性腹腔积液诊断的应用价值。方法选取我院2013年8月至2015年8月间145名腹腔积液患者作DNA定量分析检查（DNA image cytometer，DNA⁃ICM）和液基细胞学检测（thinprep cytologic test，TCT），比较其二者间诊断的敏感性和特异性。应用Logistic回归模型，绘制ROC曲线并计算曲线下面积（area under curve，AUC）来评价各指标的诊断价值。结果DNA⁃ICM检测的阳性率明显高于TCT检测。TCT检测和DNA⁃ICM检测敏感性分别为84.21％（32/38）和94.74％（36/38），特异性分别为65％（13/20）和85％（17/20）。2种方法联合诊断恶性腹腔积液的ROC曲线下面积AUC为0.94，高于2种单项检测的AUC，分别为0.90、0.75。结论两者相比较，DNA⁃ICM的敏感性和特异性明显高于TCT检测，而将2种方法相结合，可以很大地提高对恶性腹腔积液的诊断准确性。

DNA定量分析；液基细胞学；腹腔积液

腹腔积液是临床常见症状之一，能够准确的判断腹腔积液的良恶性，对于疾病的诊疗有着重要的意义。液基细胞学检测（thinprep cytologic test，TCT）是鉴别良恶性腹腔积液的重要方法，但恶性腹腔积液细胞学诊断的阳性率仅为40％左右［1］。相关研究报道细胞DNA定量分析（DNA image cytometer，DNA⁃ICM）检测腹腔积液中肿瘤细胞敏感性为88.3％，特异性为100％，TCT检测对恶性腹水诊断的敏感度为81.4％，特异性为90.4％［2⁃3］。本研究将对145例腹腔积液患者采用TCT检测和DNA⁃ICM检测，对腹水中的细胞核进行DNA倍体定量分析，并对比两者在恶性腹腔积液的诊断价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集岳阳市二人民医院2013年8月至2015年8月间腹水样本145例，其中男性65例，女性80例，年龄22～85岁，平均55岁，常规采用TCT检测和DNA⁃ICM检测。

1.2 仪器和试剂

LBP液基沉降式染色机及浆膜腔积液专用耗材（广州安必平医疗科技有限公司），全自动细胞DNA图像定量分析系统、细胞保存液以及相关制片试剂（厦门麦克奥迪医疗诊断有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 TCT检测方法

将腹腔积液标本置于离心管中，加枸橼酸钠抗凝，以3 000 rpm/min的转速离心5 min，弃上清液，置混合器上震荡30 s，往离心管中加入12 mL细胞保存液，静置5 min，弃置上清液：用吸管吸取细胞清洗液至5 mL，将标本混匀后，置漩涡混合器上震荡30 s，涂4张片，95％乙醇固定10 min，2张常规苏木精-伊红染色法（hematoxylin⁃eosin staining，HE）染色，封片，行细胞镜检，由我科2位资深病理医师阅片，镜下见炎性细胞判读为阴性，镜下见核异型细胞或肿瘤细胞判读为阳性。

1.3.2 DNA⁃ICM检测方法

将剩余2张薄层细胞片进行Feulgen染色，然后在全自动细胞DNA图像定量分析系统，进行扫描处理，该系统由MoticBA6.0全自动数码显微镜、DELL370工作站、MoticamPro205C摄像头及自动显微镜控制盒等组成，系统对全片所有细胞核进行扫描测定，标本染色质量控制采用标准片作对照。根据系统诊断软件所做的细胞DNA倍体分析，结果和建议有如下3种情况：正常细胞的DNA指数（DNA Index，DI）为1，即为二倍体细胞（2C），无异倍体细胞和异常细胞峰。4C细胞数大于被检测细胞总数的5％，但无异倍体细胞诊断为增生。有3个以上DI＞2.5的细胞或有异倍体细胞峰诊断为阳性［4⁃5］。

1.4 统计学分析

以活检病理组织诊断为标准，分别计算出TCT检测和DNA⁃ICM检测的敏感性和特异性。然后采用SPSS 17.0软件进行数据处理，用Logistic回归分析筛选变量并建立回归方程，对新变量及单项指标进行ROC曲线分析。

2 结果

2.1 TCT检测与DNA⁃ICM检测对比

145例腹腔积液标本中TCT检测37例阳性，DNA⁃ICM检测48例阳性，其中48例出现3个或3个以上DI≥2.5的异倍体细胞或异倍体细胞峰，12例出现1～2个DI≥2.5的异倍体细胞。TCT检测查见癌或疑癌细胞37例患者标本中，检测有37例均出现DI≥2.5的异倍体细胞。TCT检查见少数异型细胞的10例标本中，DNA⁃ICM检测有8例出DI≥2.5的异倍体细胞。2例TCT检查为阳性而DNA⁃ICM检测为阴性。93例良性腹水中，TCT检测有8例出现假阳性，而DNA⁃ICM检测全部阴性。2种检查方法结果比较，DNA⁃ICM检测的阳性检出率明显高于TCT检测方法，见表1、图1～3。

表1145 例良恶性腹腔积液DNA⁃ICM检测与TCT检测诊断结果（n）Table 1145 cases of benign and malignant ascites by DNA⁃ICM and TCT diagnosis（n）

图1 恶性腹腔积液患者液基细胞学检测阳性结果（HE，×200）Figure 1The positive results of TCT in patients with malig⁃nant peritoneal effusion（HE，×200）

图2 良性腹腔积液患者细胞DNA倍体检查Figure 2Benign peritoneal effusion in patients with cell DNA times physical examination

2.2 TCT和DNA⁃ICM检测与组织病理学比较

58例患者获得活检组织病理诊断结果，其中为恶性肿瘤患者39例，14例为卵巢癌，18例为胃肠道恶性肿瘤，4例为肝癌，3例为其他肿瘤。良性患者为19例，TCT检测、DNA⁃ICM检测与组织病理诊断比较，TCT检测和DNA⁃ICM检测敏感性分别为84.21％（32/38）和94.74％（36/38），特异性分别为65％（13/20）和85％（17/20）结果见表2。二者两两比较，差异无统计学意义（P＞0.01）。与此同时，对TCT检测、DNA⁃ICM检测及2种方法联合检测用Logistic回归生成的新变量（即预测概率）作ROC曲线分析，2种方法联合诊断恶性腹腔积液的ROC曲线并计算曲线下面积（area under curve，AUC）为0.94，高于2种单项检测的AUC，分别为0.90、0.75。即对恶性腹腔积液诊断能力评价ROC曲线下面积2种方法联合＞DNA⁃ICM＞TCT，AUC越大，诊断能力则越强，见图4。

图3 恶性腹腔积液患者细胞DNA倍体检查Figure 3Malignant peritoneal effusion in patients with DNA times physical examination

表2 TCT检测、DNA⁃ICM与组织病理诊断比较Table 2Comparison of TCT，DNA⁃ICM and histopathology

3 讨论

恶性腹腔积液是临床的常见症状，对于它的诊断也一直是临床面临的难题，目前有很多的检验方法及指标判断其良恶性，但各有利弊，如：脱落细胞学、肿瘤标志物、微小RNA含量检测、DNA⁃ICM检测、流式细胞术等［6⁃8］。但临床上我们常以细胞学检测为主。由于受细胞变异、蜕变以及主观因素的影响，临床的诊断率不高。因此提高恶性腹腔积液检测的敏感性和特异性一直是临床上迫切解决的问题。恶性腹腔积液主要可分为2类：一类是中央性腹水，系静脉或淋巴管堵塞所致，常多见于卵巢癌、肝癌等；一类是周围性腹水，由散布于腹膜表面的肿瘤结节分泌某些介素，导致腹膜毛细血管通透性增加所致，是晚期肿瘤患者产生腹水的主要原因。在临床上常规抽取腹水送细胞学检查，往往由于腹水恶性肿瘤细胞量少等原因检测阳性率不高，且由于间皮细胞和巨噬细胞的干扰，有时会出现假阳性。

图4 TCT检测、DNA⁃ICM检测及2种方法联合检测的ROC曲线分析Figure 4ROC curve analysis TCT，DNA⁃ICM and two kinds of methods combination for detection

TCT检测是一项制片技术，它发展于20世纪90年代。最初用于宫颈细胞学检查，随着病理学的不断发展，其在胸腹腔积液等非妇科领域也得到了运用。它具有简捷方便、快速经济、特异性高的特点，但是由于技术操作及涂片受主观影响较大，使其存在敏感性低、假阴性率高的缺点。与传统的普通制片方法相比较，TCT检测改善了样本的收集方法，除去了红细胞、粘液及炎性渗出物，能使细胞均匀完整地分布在载玻片上，同时也保全了细胞的抗原生物特性，有利于肿瘤细胞的鉴别诊断。细胞DNA⁃ICM检测是我国近几年迅速发展起来的一项新型技术，在诊断细胞学良恶性方面它有着不可替代的优越性，它是从细胞DNA的水平方面进行分析，并以点阵分布图和直方图形式描绘细胞中非整倍体细胞的个数。

对于恶性腹腔积液的诊断率，国内外相关文献报道显示，TCT检查对恶性腹水诊断的敏感度为81.4％，特异性为90.4％，DNA⁃ICM检测恶性腹腔积液敏感性为88.3％，特异性为100％［2⁃3］。本文也对此2种方法进行比较分析，并加以单项检测与联合检测作ROC曲线作对比分析。145例腹腔积液标本中TCT检测和DNA⁃ICM检测敏感性分别为84.21％（32/38）和94.74％（36/38），特异性分别为65％（13/20）和85％（17/20）。对TCT检测、DNA⁃ICM检测及2种方法联合检测用Logistic回归生成的新变量（即预测概率）作ROC曲线分析，对恶性腹腔积液诊断能力评价ROC曲线下面积2种方法联合＞DNA⁃ICM＞TCT，ROC曲线下面积越大，诊断能力则越强。与相关研究对比，本文2种方法对恶性腹腔积液诊断的敏感性与特异性稍有降低，其一可能受病理医师阅片主观所影响，其二与制片的操作技术有关，其三对是否为恶性腹腔积液的评定标准有关。因此，由以上可得出DNA⁃ICM检测的敏感性和特异性明显高于TCT检测。而将2种方法相结合，可以很大程度地降低恶性腹腔积液的误诊率和漏诊率，即可很大地提高对恶性腹腔积液的诊断准确性。同时研究显示恶性腹腔积液中，TCT检测阳性的37例标本中，DNA⁃ICM检测2例为阴性，可能因为DNA⁃ICM只能对DNA倍体已经发生改变的肿瘤细胞做出诊断，对DNA倍体未发生改变的二倍体肿瘤细胞检测呈假阴性。这可能是由于细胞在发生癌变的过程中，细胞核DNA的含量和结构的变化先于细胞形态的改变。本研究发现DNA⁃ICM检测的敏感度、特异度高于TCT的敏感度、特异度，检测效果优于TCT检测。DNA⁃ICM通过全自动数码显微镜进行阅片，仔细扫描每一个视野，降低了漏检的可能，提高了检测的敏感度。通过图像分析系统自主分析，测出每一个细胞DNA含量的具体数值，客观准确，提高了检测的特异度和准确度［6⁃7］。

由此可见，单纯的依靠DNA⁃ICM检测或TCT检测的测定，很难对腹腔积液进行精确诊断。将二者联合起来检测，能最大程度上提高恶性腹腔积液诊断的灵敏性及特异性，是目前值得推广的诊断腹腔积液的方法。

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The diagnostic value of DNA image cytometer and thinprep cytologic test for malignant peritoneal effusion

HUANG Liuyan1，LIU Chongmei2★，MAO Min2，ZOU Ya2，YANG Juan1，ZHANG Xuechun1
（1.Graduate School of University of South China，Hengyang，Hunan，China，421001；2.Department of Pa⁃thology，Yueyang Second People’s Hospital，Yueyang，Hunan，China，414000）

ObjectiveTo study the application of DNA image cytometer(DNA⁃ICM)and thinprep cytologic test(TCT)for the diagnosis of malignant peritoneal effusion.MethodsWe collected the ascites of 145 patients in the second people's hospital of Yueyang from August 2013 to August 2015.All ascites sample were detected by DNA⁃ICM and TCT,their sensitivity and specificity were then compared.Utilizing applied logistic regression,receiver operating characteristic(ROC)curve was plotted and the area under ROC curve(AUC)was calculated to assess the diagnostic value of each index.ResultsThe positive detection rate of malignant cells in ascites by DNA⁃ICM was higher than by TCT,the difference between the two methods was significant(P＜0.05).The sensitivity of TCT diagnosis of malignant ascites was 84.21％, specificity was 65％(P＜0.05).The sensitivity of DNA⁃ICM diagnosis of malignant ascites was 94.74％, specificity was 85％(P＜0.05).The AUC of the combined examination of DNA⁃ICM and TCT for malignant peritoneal effusion was 0.94,higher than the AUC of DNA⁃ICM and TCT single index examinations,which was 0.90 and 0.75 respectively.ConclusionsCompared with thinprep cytologic test,DNA quantitative analysis has a higher sensitivity and specificity.We can greatly improve the accuracy of diagnosis of malignant ascites with a combination of the two methods.

DNA image cytometer；Thinprep cytologic test；Peritoneal effusion

湖南省科技厅科技资助项目（2014SK3144）；南华大学研究生创新科研项目（2014×C×35）

1.南华大学研究生院，湖南，衡阳421001 2.岳阳市二人民医院病理科,湖南，岳阳414000

★通讯作者：刘崇梅，E⁃mail：2279700843@qq.com