刘厚明曾敏李全赵艳敏邹婧林牧赵丹肖颜玉邓群益单万水★

embB基因突变与乙胺丁醇药敏表型及耐多药关系的研究

刘厚明1曾敏2李全2赵艳敏2邹婧2林牧1赵丹3肖颜玉1邓群益4单万水1★

目的研究结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）embB306位点及其他突变位点与乙胺丁醇（ethambutol，EMB）的耐药表型及耐多药（multidrug resistant，MDR）的关系；分析embB基因突变与EMB药敏表型及MDR的关系。方法对临床分离的MTB采用BD MGIT 960 SIRE试剂比例法进行药敏试验，取48株EMB耐药、46株EMB敏感但耐其他药及7株四药均敏感MTB提取核酸并扩增embB基因全序列，对扩增产物进行测序分析embB基因序列，与H37Rv标准株序列比对，分析embB基因各突变位点、形式及频率。结果101株MTB发现embB基因序列上有17个不同位点突变形式。53株MTB在embB基因序列上发生突变，其中46株为EMB耐药，7株为EMB敏感；embB基因野生型的MTB有48株，其中2株为EMB耐药，46株为EMB敏感；embB突变型与embB野生型的MTB之间EMB耐药率有显著性差异（χ2= 68.95，P＜0.01）。101株MTB中MDR有51株，其中有42株发生embB突变，9株为embB基因野生型，embB基因突变率在MDR和非MDR之间有显著性差异（χ2=36.9，P＜0.01）。结论embB306位点与EMB耐药及MDR中度相关，embB基因突变与EMB耐药及耐多药结核菌（multidrug resistant⁃Mycobacterium tuberculosis，MDR⁃TB）高度相关，embB基因突变可作为MDR⁃TB的检测分子标记物，指导临床用药。

结核分枝杆菌；embB基因；突变；乙胺丁醇；耐多药

据世界卫生组织2013年调查数据显示，中国的结核病患者约为85.5万人，其中耐多药（multi⁃drug resistant，MDR）结核病患者约为5.4万人，我国的结核病和MDR结核病患病严重程度仅次于印度［1］，为世界第二大结核病和MDR结核病负担大国，控制耐药和MDR结核病的流行已经成为中国结防工作的迫切任务。

乙胺丁醇（ethambutol，EMB）是治疗结核病的一线用药之一，EMB作用于靶分子阿拉伯糖基转移酶，抑制了阿拉伯糖基聚合入阿拉伯半乳糖，从而影响MTB的细胞壁分枝菌酸⁃阿拉伯半乳聚糖⁃肽聚糖复合物的形成，发挥抑菌作用，使靶分子在细胞内的药物更容易进入细胞，使联合用药发挥协同作用［2］。

目前大部分研究认为MTB耐EMB与阿拉伯糖基转移酶的编码基因embABC操纵子表达增高或突变有关，其中embB基因突变改变了阿拉伯糖基转移酶结构，从而引起耐药［3］。Morkrouslv等［4］对embB306与临床结核病的EMB耐药关系之间研究显示embB序列中306位点突变最常见（约48.3％的EMB耐药和32.5％的EMB敏感但耐其他一线药的MTB发生306位点突变），但是306位点以外的embB基因突变也可引起EMB耐药，如在耐EMB分离株中，还可以检测到如下基因位点突变：285Phe→Leu、330Phe→Val、630Thr→Ile等［4⁃6］，说明除306位点外还存在其他耐EMB MTB的基因突变位点。本研究对深圳市结核病患者分离的MTB embB基因全序列（3 297 bp）进行测序分析，期许发现更多与耐EMB相关的embB突变位点，提高MTB的EMB药敏鉴定的准确性，可有效控制耐EMB结核病和MDR的流行。

1 材料与方法

1.1 研究对象

对2013年1月至2014年5月来院就诊结核病患者9 038份标本进行MTB的分离、培养和鉴定，共分离出MTB 2 243株，对其中865株进行BD MGIT 960 SIRE液体药敏试验，选取所有EMB耐药48株，占5.55％（48/865），取EMB敏感但耐其他药46株，4种药物全敏感7株，共计101株进行研究。

1.2 药物敏感性测定

使用在国际上作为MTB药物敏感性检测的“金标准”——比例法，严格按照BD MGIT 960 SIRE液体药敏试验操作说明书进行，利福平（ri⁃fampin，RFP）、异烟肼（isonicazide，INH）、EMB和链霉素（streptomycin，SM）药敏判读折点浓度分别为1 mg/L、0.1 mg/L、5 mg/L和1 mg/L，结果判读为耐药（R）或敏感（S）。本文MDR是指至少同时耐利福平和异烟肼，多耐药是指不同时耐利福平和异烟肼，但至少耐2种药。

1.3 核酸提取

取MTB培养阳性菌悬液1 mL，80℃灭活60 min，13 300 rpm离心10 min，弃上清；沉淀用1 mL生理盐水悬浮，13 300 rpm离心10 min，弃上清；重复上述步骤一次。沉淀加入50 μL去离子水，涡旋震荡混匀，干浴锅100℃×10 min，13 300 rpm离心10 min，离心后的上清即可作为PCR扩增模板。

1.4 目的基因扩增、测序及测序数据分析

将核酸提取物送至深圳华大基因研究院进行目的基因扩增测序及测序数据分析，根据M.tuber⁃culosis H37Rv菌株的标准参考序列（GenBank ac⁃cession no.NC_000962）设计embB基因全序列（3 297 bp）的PCR扩增引物，上游引物（5′⁃3′）序列为AATCAGGCTCCAGACGC，下游引物（5′⁃3′）为TACCGAGCAGCATAGGAG。PCR反应条件：（1）94℃，1 min预变性；（2）94℃，30 s变性；（3）58℃，30 s退火；（4）72℃，210 s延伸；（5）步骤（2）～（4）循环30次；（6）72℃，7 min；（7）12℃，保持。采用Sanger测序法对embB基因全序列进行测序，利用软件DNAstar Lasergene进行序列拼接和与embB基因标准序列的比对，分析突变位点。本研究对embB基因的核苷酸或氨基酸位点均采用大肠杆菌的编号系统进行描述。

1.5 统计学分析

统计学软件为SPSS 19.0分析数据，两组间的差异分析采用完全随机设计的两样本率比较（卡方检验），P＜0.05表明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 比例法液体药敏试验结果

入选的101株MTB标本比例法药敏试验，48例EMB耐药和53例EMB敏感，其中MDR 51株，多重耐药20株，结果见表1。

表1101 株MTB比例法药敏结果Table 1Results of drug sensitivity of 101 strains of MTB by ratio method

2.2 基因测序及突变结果

本次研究发现embB序列上出现的基因突变位点一共有17个，已被录入tbdreamdb结核分枝杆菌基因数据库［7］的突变位点有306、406、534、328、497（Q→K，Q→R）和1 024位点。未被记录入tbdreamdb MTB基因数据库的突变位点有113、201、246、319、330、354、405、573、521、609和679位点以及Q497P、Q497H这2个碱基替换类型。306位点突变有27株菌，26株306位点突变样本的药敏表型为EMB耐药，1株306位点突变的MTB药敏为EMB敏感。497（Q→K，Q→H，Q→P）、406、328、354、330、319、405、1 024和521位点突变的MTB药敏为EMB耐药。246、679、113和534突变位点的MTB药敏为EMB敏感。201和306位点在一个MTB上联合突变，其药敏为EMB耐药；609和330位点在一个MTB上联合突变，其药敏为EMB敏感；246、497（Q→R）和573位点在一个MTB上联合突变，其药敏为EMB敏感。具体结果如表2所示。

2.3 基因突变与EMB药敏相关性分析

101个检测样本中53株MTB发生embB基因突变，其中46株embB基因突变为EMB耐药，占86.8％（46/53），7株embB基因突变为EMB敏感，占13.2％（7/53）；48株embB基因野生型MTB中耐EMB的只有2株，embB基因野生型MTB的EMB耐药率为4.2％（2/48），46株embB基因野生型MTB为EMB敏感菌株。embB基因突变型与embB基因野生型MTB的EMB耐药率进行比较，有统计学意义，二者有显著性差异，embB突变型MTB的EMB耐药率明显比embB野生型MTB的EMB耐药率高。详细结果见表3。

2.4 基因突变与MDR⁃TB相关性分析

根据表4，101个样本中MDR⁃TB一共有51株，其中embB基因突变型的MDR⁃TB有42株，占82.3％（42/51）；embB基因野生型的MDR⁃TB有9株，占17.6％（9/51）。MDR⁃TB在embB基因突变型和embB基因野生型之间进行比较，有统计学意义，二者有显著性差异，embB基因突变率MDR⁃TB较非MDR⁃TB更高。详细结果见表5。

3 讨论

embB基因突变与MTB的EMB药敏表型及MDR的关系：吴雪琼等［2，5］相关研究发现36％～69％的MTB耐EMB分离株有embB基因突变，本次研究深圳市MTB基因检测结果显示耐EMB的MTB分离株中embB基因突变检出率为95.8％（46/48），深圳市MTB耐EMB的embB基因突变率更高。embB基因突变型与野生型EMB耐药率有统计学意义，embB基因突变型比野生型EMB耐药率明显增高，提示embB基因突变与EMB耐药密切相关，与大多数研究文献的结论一致［5，8⁃12］。因此笔者认为MTB发生embB基因突变与深圳地区的MTB耐EMB高度相关。

表2 embB各突变位点的氨基酸改变与MTB药敏结果分析Table 2Analysis of amino acid change and MTB drug sensitivity ofembBin different mutation sites

Ramaswamy等［12］和Shi等［13］文献指出embB基因突变可能是MDR流行的原因之一。本研究中，MDR⁃TB在embB基因突变型与野生型之间比较有统计学意义，embB基因突变型MTB MDR率明显比野生型的MTB MDR率要高，提示embB基因突变与MDR之间高度相关。Shi等［13］在研究河南的结核病embB基因突变特征中发现138株MDR中119株MDR检测到embB突变，突变率为86.2％（119/138），与本研究结果相似，因此，我们认为embB基因突变可能是深圳市MDR⁃TB流行的主要原因之一，embB基因突变的检出可以有效预测深圳市结核病的MDR情况。在尚未发现明确的MDR检测分子标记物之前，笔者认为embB基因突变可作为诊断MDR⁃TB的检测分子标记物。

表3 embB基因突变型与embB基因野生型的MTB的EMB耐药对比分析（株）Table 3Analysis of drug resistance of EMB betweenembBgene mutation and wild type in MTB(strains)

表4 MDR⁃TB药敏情况统计Table 4Results of MDR⁃TB drug sensitivity

embB306位点突变与MTB的EMB药敏表型及MDR的关系：近年来有大量的文献和研究表明发生embB突变的EMB耐药MTB中约有27％～87％的突变发生在306位点上［8⁃9，14⁃15］，本研究中，306位点突变菌株为27株，占embB基因突变位点样本的49.3％（27/53），证实了embB306突变确实与MTB耐EMB有关，但并不能认为embB306位点突变直接导致MTB耐EMB［13，15⁃17］。本研究单独检测embB306突变诊断MTB对EMB耐药灵敏度54.2％（26/48），通过检测embB基因所有突变位点，可以提高灵敏度至95.8％（46/48），这提示embB基因上多个位点均可能参与了MTB的EMB耐药发生，与Shi等［13］的研究结论一致。306位点突变检测EMB耐药性在临床应用上有一定的局限性，但该位点是目前MTB耐EMB的最高频突变位点。本研究被检测到embB306位点突变的MTB的EMB耐药率96.3％（26/27），特异度98.1％（52/53），306位点的检出提示该菌株对EMB耐药中度相关。embB基因突变检测和306位点检测都可用于临床MTB的EMB耐药的预测，embB基因检测与306位点检测联合应用可提高诊断的灵敏度和特异度，可使MTB的EMB药敏结果更准确可靠。

Safi等［18］的研究以及在笔者［19］以前研究的embB306位点与MDR相关性结论认为embB306不仅与EMB耐药相关，与其他3种一线药物RFP、INH和SM也有相关，本研究embB306位点突变MTB的MDR率为81.5％（22/27），embB306位点与MDR相关。张楠等［20］研究认为306位点可以作为MDR⁃TB的检测分子标志物，本研究结果显示MTB发生embB306位点突变的MDR率为43.1％（22/ 51），306位点诊断MDR⁃TB的灵敏度较低，因此，我们认为306位点作为MDR⁃TB的检测分子标志物可靠性一般；发生embB基因突变的MDR率为82.3％（42/51），306位点与其他突变位点联合应用可提高MDR检测方法的灵敏度，306位点是embB基因上与MDR⁃TB相关的一个重要的突变位点在实验室诊断EMB耐药和MDR⁃TB中有较高的参考价值。

表5 embB基因突变型与embB基因野生型的MDR⁃TB情况对比分析（单位：株）Table 5Analysis of MDR⁃TB between embB gene mutation and wild type(strains)

embB406和497位点突变与MTB的EMB药敏表型及MDR的关系：有相关研究表明406和497位点是除306位点以外在embB基因上被发现最多的2个突变位点［15］，本研究结果与上述研究一致。本研究embB406位点突变株EMB耐药率为100％（5/5），MDR率为80％（4/5）；embB497突变株EMB耐药率为83.3％（5/6），MDR率为83.3％（5/6）。406和497位点的EMB耐药率和MDR率相当高，近年来越来越多的研究显示406和497位点与EMB耐药相关［13，15，21⁃25］，406位点或497位点发生突变会导致MTB对EMB低浓度耐药［23］，因此笔者认为406位点和497位点突变与EMB耐药高度相关，406位点、497位点和306位点都是诊断MTB耐EMB的重要检测突变位点。

Xu等［15］研究认为EMB耐药的MTB突变发生在406或497位点上的均为MDR⁃TB，本研究结果与上述结论不完全相符，但多个研究显示在MDR⁃TB中检测到406或497位点突变的频率在5％～ 15％之间［13，15，22，24］，我们的结果与之相符。笔者认为emb406和embB497突变位点与MDR⁃TB耐一线药相关，是除了306位点以外的另外2个与MDR⁃TB相关的重要embB突变位点，可应用于临床诊断MTB的EMB耐药和MDR相关性的预测。

embB328、354和1024位点突变与MTB的EMB药敏表型及MDR的关系：embB328、354这4个突变位点都被记录入tbdreamdb数据库，4个位点突变的MTB药敏结果都是EMB耐药，相关的研究显示embB328［13，15，21，24，26］、354［13，15，21，26］和1024［13，21］位点都是在耐EMB的MTB被检测到。本研究中，embB328位点突变的MTB有4个，embB354位点突变的MTB有2个，embB1024位点突变的MTB只有1个，这些突变的样本都是MDR⁃TB，且都是耐EMB的MTB，笔者认为他们与MTB对EMB耐药及MDR⁃TB相关。单独检测一个embB306基因位点耐EMB的灵敏度为54.2％（26/48），联合306、406、497、328、354和1024位点可提高灵敏度至81.3％（39/48），embB328、354和1024位点可应用于预测MTB耐EMB和MDR相关性，为实验室建立EMB耐药检测方法提供了理论依据。

embB405、521、330、319、534、246、113、679、201、609和573位点突变与MTB的EMB药敏表型及MDR的关系：以上突变位点突变株较少，突变位点未被记录入tbdreamdb数据库，或虽有记录入tb⁃dreamdb数据库，但相关文献［13⁃15，21⁃24，27］研究没有指出其突变与EMB药敏表型及MDR的关系，结合本研究，尚不能确定以上突变位点与MTB的EMB耐药及MDR之间的关系。

综上所述，embB306位点与EMB耐药及MDR中度相关，306位点突变检测EMB耐药和MDR在临床应用上有一定的局限性，与其它位点如embB406、497联合应用可提高检测方法的灵敏度，在实验室诊断EMB耐药和MDR⁃TB中有较高的参考价值。embB基因突变与EMB耐药及MDR高度相关，embB基因突变可作为MDR⁃TB的检测分子标记物。embB基因embB306、497、406、328、354、1024、319、330、405和521位点突变与EMB耐药相关，认为embB基因序列上900～1500位点之间是高频突变区，与Shi等［13］的研究一致，该序列区域发生突变与EMB耐药高度相关，我们将其命名为EMB耐药决定区域（ethambutol resistance determining region，ERDR），为实验室建立快速诊断MTB的EMB耐药性和MDR的检测方法提供了理论依据，为临床对EMB耐药MTB感染的治疗具有指导意义。

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Assosciation between embB mutation and drug resistance and MDR in Mycobacterium tuberculosis for ethambutol

LIU Houming1,ZENG Min2,LI Quan2,ZHAO Yanmin2,ZOU Jing2,LIN Mu1,ZHAO Dan3,XIAO Yanyu1, DENG Qunyi4,SHAN Wanshui1★
(1.Department of Clinical Laboratory,the Third People's Hospital of Shenzhen City,Shenzhen,Guangdong, China,518112;2.Beijing Genomics Institute⁃Shenzhen,Shenzhen,Guangdong,China,518083;3.Department of Clinical Laboratory,Luohu Chronic Disease Prevention and Cure Hospital,Shenzhen,Guangdong,China, 518029;4.Department or Tuberculosis,the Third People's Hospital of Shenzhen City,Shenzhen,Guangdong, China,518112)

ObjectiveTo determine Mycobacterium tuberculosis(MTB)embB306 and other loci molecular mutations and their association with ethambutol(EMB)resistance phenotype and multidrug resistant (MDR);to determine molecular mutation in embB gene and its association with EMB resistance phenotype and MDR.MethodsThe drug sensitivity test was carried out using ratio method by BD 960 MGIT SIREreagent for clinical isolates of MTB,the DNA of 48 EMB resistance,46 EMB sensitive but resistance to other drugs and 7 sensitive to four drugs of MTB were extracted and amplified embB gene sequence.The amplified products were then sequenced and analyzed the embB gene sequence of each MTB,compared with H37Rv standard strain in Genbank,the mutation sites,the form and the frequency of embB gene were analyzed. Results17 different mutant forms were found in 101 strains of MTB embB gene.53 strains of MTB mutated in the embB gene,46 strains of which were EMB resistant,7 were EMB sensitive;48 strains of MTB were wild type in the embB gene,2 strains of which were EMB resistant,46 were EMB sensitive.There were significant differences in the drug resistance positive rates of EMB between embB mutation and embB wild type(χ2=68.95, P＜0.01).There were 51 strains MDR in 101 MTB,including 42 strains of embB mutation,and 9 strains of embB wildtype,the mutation rate of embB gene was significantly different between MDR and non⁃MDR(χ2= 36.9,P＜0.01).ConclusionembB 306 mutation is moderately related to EMB resistance in MTB,mutation of embB gene is highly associated with EMB resistance and MDR⁃TB,the embB gene can be used as a marker for the detection of MDR⁃TB,which could be used guideline for clinical drug use.

Mycobacterium tuberculosis;embB gene;Mutation;Ethambutol;MDR

深圳市科技创新委员会基金（JCYJ2013040116479996，JCYJ20140411113637598）；深圳市三名工程专项基金；深圳市科技研发资金（ZDSYS201504301534057）

1.深圳市第三人民医院检验科，广东，深圳518112 2.深圳华大基因研究院，广东，深圳518083 3.深圳市罗湖区慢性病防治院检验科，广东，深圳518029 4.深圳市第三人民医院肺病科，广东，深圳518112

★通讯作者：单万水，E⁃mail：shanwanshui152@aliyun.com