张洁明杨学习

·论著·

肺癌患者EGFR及KRAS基因突变检测方法的建立和临床应用

张洁明1杨学习2★

目的本研究拟在评估二代测序（next generation sequencing，NGS）技术在肺癌临床分子诊断中应用的可行性。方法本研究选取108例肺癌石蜡包埋样本（formalin fixed paraffin embedded，FFPE），同时进行一代测序（sanger sequencing）和NGS检测样本中EGFR和KRAS基因的突变情况。结果在108例肺癌样本中，一代测序检出突变在二代测序中均检出，另外NGS还检测出目标区域外其他突变。结论NGS的检测准确性可达到100％。NGS可以应用于肺癌临床分子诊断，同时NGS能给临床提供更详细的基因突变信息，为分子靶向治疗提供依据，更具有市场潜力及应用前景。

二代测序；肺癌；EGFR；KRAS

肺癌是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一［1⁃2］，同时其也是我国发病率及致死率最高的癌症。近年来，分子靶向药物因其特异、高效、副作用小的特点而得到了广泛推广和临床应用。但由于肿瘤异质性产生药物敏感性差异，在给予靶向治疗前，需确认特定靶点基因的状态，从而评估每位患者对特定药物的敏感性和毒副反应的大小，有针对性地使用抗癌药物［3］。

肺癌靶向药物治疗的相关基因包括EGFR和KRAS［4⁃5］，其突变状态的检查在临床治疗中的意义日益凸显。目前常规分子病理检测方法是采用实时荧光定量核酸扩增检测（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）技术或一代测序技术。qPCR技术对单个基因已知突变进行定性和定量检测，一代测序可以测定单个基因指定突变位点的附近序列（限于单个外显子）。但以上方法仅限于已知突变，且通量低（一般一个反应只能检测一个突变或一个外显子）、灵敏度低，难以检出样本中低丰度突变及未知突变。

第二代测序具有高通量、自动化、低成本的特征，它能在很短的时间内完成对上百亿碱基的测序，满足极短时间内对基因组进行高分辨率的检测的要求［6］，它能够一次检测多个基因的多个突变热点附近的序列，从而同时鉴别出已知和未知的突变类型，节省肿瘤样本DNA用量，检测性价比高［7⁃8］。本研究采用Ion Torrent测序法测定肺癌患者石蜡包埋组织样本EGFR和KRAS基因突变情况。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

QIAamp®DNA FFPE Tissue Kit购自德国Qia⁃gen公司；Ion AmpliseqTMlibrary kit 2.0，Ion PI™Template OT2 Kit v3，Ion PITMHi⁃QTMSequencing 200 Kit均购自美国Life Technology公司；Nuclease⁃Free Water购自美国Life Technologies公司；无水乙醇（分析纯）购自广州化学试剂厂；基因测序仪（DA8600）由中山大学达安基因股份有限公司提供；ABI 3500由中山大学达安基因股份有限公司提供。

1.2 研究对象

随机选取2013年至2015年间宁波市第二医院在病理学上确诊为非小细胞肺癌的石蜡包埋组织样本108例。男性患者58例，女性患者50例，年龄在35岁到88岁之间。研究经医院医学伦理会审核批准，患者签署知情同意书。

1.3 实验方法

1.3.1 DNA提取

使用QIAamp®DNA FFPE Tissue Kit提取石蜡包埋组织样本DNA。通过脱蜡，溶解细胞，吸附DNA，除杂等步骤获取DNA。

1.3.2 二代测序

二代测序有4个步骤，分别是基因组DNA提取，文库构建，上机测序和生物信息学分析，具体内容见图1。根据测序需要，使用Ion AmpliseqTMli⁃ brary kit 2.0将提取的DNA构建成文库DNA。PCR特异性扩增目的片段，在DNA片段两端加上通用测序接头，PCR扩增文库DNA，磁珠纯化去除杂质。建库后使用核酸定量仪测定文库DNA的浓度。PI芯片一次上机测序能得到的数据在10 G左右，根据每个样本测序数据需求量和测序深度确定混样个数，混合样本，再测定混样后DNA浓度，稀释到200 pmol/μL，取800 pmolDNA做模板制备。稀释倍数公式如下。使用Ion PI™Template OT2 Kit v3制备测序模板。在PCR反应体系中加入文库DNA和模板载体，油包水PCR，富集测序模板去除杂质及扩增失败的测序模板。使用Ion PITMHi⁃QTMSequencing 200 Kit在基因测序仪（DA8600）上测序。初始化测序仪，测序模板loading入测序芯片，上机测序。

稀释倍数=Qubit浓度（ng/μL）×107/（200× 660×2）。

1.3.3 二代测序数据分析

图1 二代测序流程图Figure 1Progress of NGS

上机测序数据通过Torrent source进行后续信息分析。运行Variant Caller和Coverage Analysis插件，得到样本的分析结果。点击“筛选”，在“检测结果”选项中，筛选保留“杂合突变”和“纯合突变”，当“突变频率”值≥5％时，检测结果为相应基因突变型别；“突变频率”值＜5％时，检测结果为相应基因位点野生型。在“突变热点”选项中显示“Hotspot”的基因突变为常见突变，其指示的COSMIC ID可以在COSM网站获取相应的基因突变信息；在“突变热点”选项中显示“Novel”的基因突变为罕见突变或新突变。Coverage Analysis可显示“测序深度”及“覆盖度”，评估测序质量。按照上述方法，对收集的石蜡包埋组织样本进行EGFR和KRAS基因测序。

1.3.4 一代测序

108例FFPE样本使用一代测序方法进行检测（本实验室自行检测），结果作为对照。使用步骤1.3.1提取的DNA，进行PCR对目的片段扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增效果，对扩增产物纯化，测序反应体系配置，测序反应前扩增，使用达瑞生物购置的ABI 3500一代测序仪进行测序。

1.3.5 一代测序数据分析

搜索待测突变区域前序列，比对基因序列，若同时具有突变碱基峰，则为杂合突变；若只出现野生碱基峰，则为野生型；若只出现突变碱基峰，则为纯合突变。

2 结果

2.1 测序结果

本次研究收集108例肺癌组织样本，二代测序结果显示EGFR基因野生型87例，EGFR基因突变型共21例，其中L858R突变有15例，E746_A750delELREA突变有3例，L747⁃T751del、V769_D770insASV均只有1例，双突变G719S及S768I有1例。KRAS基因突变情况，KRAS基因野生型75例，KRAS基因突变型共33例，其中Gly12Asp突变有15例，Gly12Cys突变有5例，Gly12Val突变有4例，Gly13Asp突变有4例，Gly12Ala突变有2例，Gly12Ser、Gly12Arg均有1例，双突变Gly12Asp及Gly12Cys有1例。

针对EGFR第18～21号外显子、KRAS第2号外显子进行一代测序。结果显示EGFR基因野生型87例，EGFR基因突变型共21例，其中L858R突变有15例，E746_A750delELREA突变有3例，L747⁃T751del、V769_D770insASV均只有1例，双突变G719S及S768I有1例。KRAS基因野生型75例，KRAS基因突变型共33例，其中Gly12Asp突变有15例，Gly12Cys突变有5例，Gly12Val突变有4例，Gly13Asp突变有4例，Gly12Ala突变有2例，Gly12Ser、Gly12Arg均有1例，双突变Gly12Asp及Gly12Cys有1例。检测结果见表1，文章篇幅有限仅展现10例样本。

2.22 种测序方法结果对比

比对一代测序结果，一代测序检出突变二代测序均有检出。EGFR基因检测2种方法均为阳性共21例，两种方法均为阴性87例，一代测序阳性二代测序阴性共0例，一代测序阴性二代测序阳性共0例。灵敏性即二代测序检出突变病例占对照组检出突变病例的比例，又称真阳性率。特异性指二代测序检出无突变病例占对照组未检出突变总数的比例，又称真阴性率。准确性指真阳性和真阴性占总样本数的比例。二者检测结果一致，灵敏性、特异性、准确性均为100％。KRAS基因检测两种方法均为阳性共33例，2种方法均为阴性75例，一代测序阳性二代测序阴性共0例，一代测序阴性二代测序阳性共0例。二者检测结果一致，灵敏性、特异性、准确性均为100％。

表1 测序检测结果Table 1Sequencing results in detail

表2 二代测序检测结果Table 2NGS results in detail

2.3 二代测序灵敏性

二代测序还检测出其他突变，这些都是在一代测序检测位点外或突变频率较低的突变。表2为其中5例样本的检测结果。

3 讨论

本次实验检测2个基因6个外显子上的突变情况，其中EGFR基因第18～21号外显子、KRAS基因第2、3号外显子。实验中108例样本二代测序结果与一代测序目标检测区域结果相符。另外，二代测序还检测出样本存在其他基因突变，如TP53、PTEN、CTNNB1、PIK3CA、BRAF。二代测序技术具有高通量的特点，能一次检测多个基因的多个位点，节省样本DNA用量，仅需少量样本即可检测大部分基因突变情况，减少采集样本的难度及降低患者痛苦。一代测序可检测单个基因突变位点附近的全部序列，但通量低（一般单个测序反应只能检测单个外显子），只能对突变位点进行定性检测而不能定量检测，且其检测灵敏度不及二代测序，难以检出样本中低丰度突变，当某一外显子存在多种突变时，一代测序的峰图易受干扰，难以判断突变类型，所以一代测序难以将复杂突变样本准确检出其突变型。二代测序可以节省大量检测时间，特别是需要同时检测多个基因的情况下，更快得到检测结果，及时进行治疗。另外，二代测序还可以发现其他基因上的突变，可以为临床医生提供更多的信息，更利于治疗药物的选择；还可以发现新的肺癌相关基因。二代测序与一代测序检测结果高度一致，二代测序在检测时间和检测通量上比一代测序更有优势，更能满足目前临床检测及科研实验的需求。

研究发现，在非小细胞肿瘤个体化用药指导治疗中，及时了解癌变组织基因突变状态至关重要。根据自身情况使用相应的治疗药物可以有效地控制病情的发展［9⁃10］。根据2014年美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）的《非小细胞肺癌临床实践指南（中国版）》，KRAS突变和EGFR⁃TKI内源性耐药有关，KRAS野生型患者建议接受EGFR⁃TKI治疗［10］。目前化疗药物对癌症细胞针对性弱，部分患者本身基因存在突变对药物产生耐性，并且化疗药物副作用大，疗程长，治疗效果不明显。靶向治疗药物针对性强，副作用低，通过测序检测患者基因突变状态有利于医生选择治疗药物，及时控制病情，降低患者痛苦和负担。本次检测出EGFR突变型21例，KRAS野生型75例，这些患者对TKI敏感，建议使用吉非替尼、厄洛替尼、尼洛替尼等药物治疗。基因检测可以及时了解患者基因突变情况，为临床用药提供指导，实现个性化用药。本次检测仅针对肺癌相关基因EG⁃FR和KRAS，但二代测序可以同时检测多个基因，如NRAS、BRAF、TP53等。NRAS突变存在于造血系统的恶性肿瘤［11］，在急性粒细胞白血病及骨髓异常增生综合征中NRAS突变率为25％。BRAF突变存在于结直肠癌和黑色素瘤［12］。KRAS突变也发生在胰腺癌和结直肠癌中［13⁃14］。大部分甲状腺癌存在3种癌基因（KRAS、HRAS、NRAS）的突变［15］。TP53突变存在于多种癌症当中。癌症发生并不局限于单个基因，而某个基因突变也可能存在于多种癌症［16］。二代测序不局限于肺癌临床检测，也可以应用于其他癌症当中，二代测序具有强大的发展潜力和市场前景。

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A new method of gene mutation status detection onEGFRandKRASof lung cancer patients and the assessment of clinical application

ZHANG Jieming1，YANG Xuexi2★
（1.Guangzhou Darui Biotechnology Co.，LTD.，Guangzhou，Guangdong，China，510665；2.Institute of Antibody Engineering，School of Laboratory Medicine and Biotechnology，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515）

ObjectiveThe feasibility of application of next generation sequencing(NGS) technology in clinical molecular diagnosis of lung cancer was evaluated in this study.MethodsIn this study,the variants of the EGFR and KRAS genes from 108 paraffin⁃embedded tissues of lung cancer were detected by both Sanger sequencing and NGS.The variants detected by Sanger sequencing were as also detected by NGS.ResultsIn 108 cases,NGS detected all the mutations which sanger sequencing detected. In addition,NGS also detected other gene mutation status that Sanger sequencing missed.ConclusionThe detection accuracy of NGS could reach 100％.NGS could be used in clinical diagnosis of lung cancer,and NGS can provide more detailed gene mutation information for clinical diagnosis,which provides the basis for molecular targeted therapy.Moreover NGS also has the market potential and application prospects.

Next generation sequencing；Lung cancer；EGFR；KRAS

广东省科技计划项目应用型专项资金（2015B020233009）

1.广州市达瑞生物技术股份有限公司，广东，广州510665 2.南方医科大学检验与生物技术学院抗体工程研究所，广东，广州510515

★通讯作者：杨学习，E⁃mail：yxxzb@sohu.com