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·论著·

NGS检测乙型肝炎病毒耐药基因突变情况及其临床意义

王创俊1王庆1曹治家1杨学习2★

目的检测乙型肝炎患者的HBV YMDD突变情况，探究下一代测序技术（next generation sequencing，NGS）检测HBV耐药基因突变的可行性及患者性别与其YMDD突变的相关性，并为临床用药提供参考。方法运用NGS测序技术对收集的100例临床样本进行HBV YMDD突变的检测，并与临床检测金标准Sanger测序法的测序结果进行比对。结果运用NGS检测100例HBV样本，其中YMDD野生型88例，HBV YMDD耐药基因突变12例，与Sanger测序法的测序结果完全相符。结论本研究结果显示，NGS技术可用于HBV耐药基因突变检测，患者性别与HBV耐药突变无明显相关性。

NGS；HBV；耐药基因突变

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染呈世界性分布，据世界卫生组织（World Health Orga⁃nization，WHO）的数据显示，全球约有2.4亿感染者，每年约有80万人死于与HBV相关的肝脏疾病［1］。根据中国疾病预防控制中心的统计数字，截止至2015年7月份，中国乙肝病毒感染者达到9 000万［2］。目前临床上对乙型肝炎主要的治疗方法是抗病毒治疗，国内外普遍使用的药物有干扰素和核苷（酸）类。其中拉米夫定（Lamivudine，LAM）别称3TC，作为第一个被批准使用的核苷类治疗药物，因其抑制病毒复制能力强及使用方便且疗效确切，适用于不同阶段的肝病患者，是长期治疗的合理选择。但因其无法清除肝细胞内病毒的超螺旋cDNA，患者长期用药时，易发生耐受的情况［3⁃4］。另外，HBV复制过程中存在逆转录过程，逆转录酶缺乏校正活性且病毒复制速率又保持在较高水平，因此产生了大量的核苷酸错配，使HBV在宿主体内表现为大量的基因序列有差别［5］。HBV酪氨酸⁃甲硫氨酸⁃天门冬氨酸⁃天门冬氨酸（YMDD）变异对拉米夫定用药产生影响，基因组变异为rt180、rt204和rt207［6］。

本研究运用Ion Torrent ProtonTM测序系统［4］对收集的100例临床样本进行HBV耐药基因变异的检测，并与临床检测金标准的Sanger测序结果进行比对，验证NGS检测技术检测乙肝患者的HBV YMDD突变的可行性，探究患者性别与HBV耐药基因变异的相关性，为临床治疗方案的调整提供参考。

1 材料与方法

1.1 样本

选取福建协和医院经临床确诊为HBV耐药的血清样本100例，其中男性68例，女性32例，年龄22～65岁，平均年龄（37.02±12.07）岁；阴阳性质控品各1例。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

本实验主要仪器信息见表1。

1.2.2 试剂

本实验主要试剂信息见表2。

表1 仪器信息Table 1The information of instruments

表2 试剂信息Table 2The information of reagents

1.3 方法

1.3.1 样本DNA提取

使用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取试剂盒（离心柱法），严格按照试剂盒说明书进行操作，使用Qubit®3.0荧光计或同类仪器对提取后的核酸进行定量。提取后的DNA保存于-20℃。1.3.2DNA文库构建

提取得到的DNA样本经过定性PCR方法扩增后采用生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒进行纯化，使用Ion AmpliSeq™Library Kit 2.0（Life Technologies公司，美国）进行HBV样本文库构建。具体建库流程如：末端补平→产物纯化→连接接头→产物纯化→扩增产物→产物纯化→文库定量→完成建库。

文库构建完毕存放于4℃冰箱，留待后续模板制备、模板富集实验用。

1.3.3 上机测序

1.3.3.1 混合文库

将1.3.2中得到的DNA文库浓度稀释到200 pmol/L，等体积混合后，留待下一步实验操作。

1.3.3.2 模板制备和模板富集

使用Ion PITMHi⁃QTMOT2 Reagents 200 kit（Life Technologies公司，美国）试剂盒，在Ion One TouchTM2.0 System仪器（Life Technologies公司，美国）上严格按照说明书操作［7］，对上一步实验得到的样本文库进行模板制备和模板富集。

1.3.3.3 DA8600测序仪测序

使用Ion PITMHi⁃Q™Sequencing 200 Kit（Life Technologies公司，美国）试剂盒，严格按照说明书操作对上一步实验模板制备和模板富集所收集到的混合文库样本进行基因测序。

测序质控标准：1）阳性质控品：以6 μL阳性质控品作为待检品，按照试剂盒说明书进行检测，检测结果应为相应型别的阳性。2）阴性质控品：以6 μL阴性质控品作为待检品，按照试剂盒说明书进行检测，检测结果应为相应型别的阴性。3）以上1）、2）需要同时满足，否则需要重新实验。

1.3.4 对照实验

使用中山大学达安基因股份有限公司生产的乙型肝炎病毒耐药基因突变检测试剂盒（PCR⁃测序法）（国食药监械（准）字2014第3401444号）对100例样本进行对照实验，验证NGS测序技术测序结果。

2 结果

2.1 HBV YMDD突变检测结果

NGS测序技术检测得到的结果为，100例HBV样本中，共检出HBV YMDD野生型88例，HBV YMDD突变型12例（其中YIDD变异8例，YVDD变异4例），且与对照方法Sanger测序结果比对正确率100％，如表3。

2.2 HBV YMDD突变与年龄的相关性

HBV耐药基因野生型（YMDD）样本中，男性59例，女性29例；HBV耐药基因突变样本中，男性8例，女性4例，两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）（表4）。

表3 HBV耐药基因突变NGS检测结果Table 3The results of HBV drug⁃resistance gene sequencing

对表4数据做卡方检验，假设H0=患者性别与HBV耐药基因突变不相关，H1=患者性别与HBV耐药基因相关。由卡方检验公式，得x2=1.950 4＜ x2（0.05，1）=3.84，即P＞0.05，拒绝H1，接受H0。结论：患者性别与HBV耐药基因突变不相关。

表4 HBV耐药基因突变与性别的相关性Table 4The correlation between patients’gender and HBV YMDD mutation

2.32 种检测方法相关性分析

100例样本中，经对照方法Sanger测序法检测，HBV耐药基因野生型有88例；HBV耐药基因突变型有12例，其中YIDD突变有8例，YVDD突变有4例。则HBV耐药基因检测率为12.0％［7］。经NGS测序技术检测，乙肝耐药基因突变型有12例，其中YIDD突变有8例，YVDD突变有4例；野生型（YMDD）有88例。Sanger测序法和NGS测序法两者检测结果均一致，灵敏性、特异性、准确性均为100％，见表5。

表52 种测序技术测序结果比较Table 5The results comparision of NGS and Sanger Sequencing

由表5中数据可得，本次实验的灵敏性=100％×［a/（a+c）］，特异性=100％×［d/（b+d）］，总符合率= 100％×［（a+d）/（b+c）］。灵敏性即待考评试剂检出突变病例占病例组总数的比例，又称真阳性率。即灵敏性=12/（12+0）×100％=100％。特异性指待考评试剂检出无突变病例占对照组总数的比例，又称真阴性率。即特异性=88/（0+88）×100％=100％。准确性指真阳性和真阴性占总样本数的比例。即准确性=（12+88）/100×100％=100％。

3 讨论

本实验主要运用NGS测序技术对100例样本进行检测，NGS是基于半导体技术，基因测序芯片的每个微孔里的微球表面含有样品DNA序列的分子拷贝。本次检测结果为100例样本中，HBV耐药基因野生型88例，突变型12例。此外，本实验设置目前临床检测基因突变的“金标准”测序法——Sanger测序法测序结果作为对照，比对发现NGS测序技术与“金标准”测序法的测序结果完全相符，灵敏性、特异性、准确性均为100％。

在HBV病毒的耐药机制中DNA多聚酶扮演着极其重要的角色。HBV基因组正股（短链）在DNA多聚酶作用下延伸合成闭合环状DNA（cccDNA），以此为模板在宿主肝细胞酶的作用下转录成复制中间体——前基因组RNA，再以此为模板在病毒RNA指导的DNA多聚酶（逆转录酶）作用下逆转录成第一股子代DNA。在DNA多聚酶作用下以第一股子代DNA为模板合成第二股子代DNA。该双股DNA部分环化，完成HBV基因组的复制。拉米夫定通过与HBV DNA多聚酶结构域P区序列发生特异性结合，竞争抑制酶活性，从而有效抑制HBV DNA的复制［9］。在长期服用拉米夫定过程中，患者容易产生耐受，主要是DNA多聚酶P基因区的酪氨酸⁃甲硫氨酸⁃天门冬氨酸⁃天门冬氨酸（YMDD）序列发生变异［10］，甲硫氨酸（M）被缬氨酸（V）或异亮氨酸（I）替代，使人体对拉米夫定产生耐受，造成病情加重甚至死亡的严重后果［11⁃12］。

本次研究提示，YIDD和YVDD变异株的检出率并不一致，YIDD变异株检出率比YVDD变异株检出率高，与方莉等［12］及郑瑞英等［13］的结果相符，后续可设计实验验证是否突变类型与治疗方案相关。普冬等［14］提示，临床上应用拉米夫定治疗的患者，YMDD变异株检测率会随着治疗时间延长而增加。分析其原因，本研究认为HBV位点突变情况及检出情况提示HBV病毒群的演变符合达尔文进化论的规律。部分位点的变异对其复制能力没有显著影响，部分位点的变异可能会使子代病毒的复制能力增强或降低。对于HBV病毒群，临床上应用拉米夫定对其有一个压力选择的影响，因此在临床上体现为YMDD变异株检出率的差别。研究后续或可深入探究验证其耐药突变位点变异对病毒复制能力的影响。

由于YMDD变异直接影响临床使用拉米夫定的疗效和预后判定，因此，临床上应用拉米夫定的乙型肝炎患者检测了解HBV耐药基因变异情况，有利于及时调整制定治疗方案，对改善乙肝患者病情和有效治疗疾病有着相当重要的意义。

本研究中对NGS检测HBV耐药基因YMDD突变的可行性进行了探讨，发现采用NGS测序技术可准确检测出HBV耐药基因突变，对临床中乙肝患者HBV耐药基因检测及用药具有重要意义。但对于NGS测序技术检测HBV耐药基因突变所需样本DNA用量及可检出的最低突变频率并没有进行深入研究，后续我们将对此进行进一步的探讨，为临床上乙肝耐药基因的检测提供参考依据。

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Next generation Sequencing in study of drug⁃resistance genes and the clinical significance of hepatitis B virus

WANG Chuangjun1,WANG Qing1,CAO Zhijia1,YANG Xuexi2★
(1.Guangzhou Darui Biotechnology Co.，LTD.,Guangzhou,Guangdong,China,510665;2.Institute of Antibody Engineering,School of Laboratory Medicine and Biotechnology,Southern Medical University, Guangzhou,Guangdong,China,510515)

ObjectiveTo explore the feasibility of HBV resistance mutation detection by next generation sequencing(NGS)technology as well as to examine the correlation of the patient's gender with his or her YMDD mutation.Thus,it can provide a reference for clinical diagnostic agents.MethodsNGS technology was used in this study to detect the HBV YMDD mutation from 100 collected cases of clinical samples.These results were compared with the Sanger sequencing results,which is the gold standard for clinical detection.ResultsIn these 100 cases of HBV samples,88 cases of HBV YMDD wild type and 12 cases YMDD resistant mutation were detected.The sequencing results were the same as the Sanger sequencing results.ConclusionsThe results of this study showed NGS technology can be used to detect HBV resistance mutations.Furthermore,the patient's gender has no signifi cantcorrelation with the HBV resistance mutations.

NGS;HBV;Resistance gene mutations

广州市健康医疗协同创新重大专项（201400000004⁃1）

1.广州市达瑞生物技术股份有限公司，广东，广州510665 2.南方医科大学检验与生物技术学院抗体工程研究所，广东，广州510515

★通讯作者：杨学习，E⁃mail：yxxzb@sohu.com