■冯 健 李英花 耿春银 严昌国

(延边大学农学院，吉林延吉133002)

1 试验材料

1.1 试验动物

选择12头平均体重（545.55±27.00）kg的体健无病延边黄牛阉牛，随机分成试验组和对照组,每组6头，试验组每头牛饲喂生物发酵饲料2 kg/d，对照组不饲喂生物发酵饲料,试验组和对照组的基础日粮营养水平基本相同。预饲期10 d，正式期90 d。屠宰后，分别从试验组与对照组各随机选取3头牛，在第14肋骨处采取背最长肌一小块，迅速放于事先处理好的冻存管中并置于液氮中速冻，-80℃保存待用。

1.2 试验日粮

生物发酵饲料是利用玉米粉40%、啤酒糟40%、糖蜜5%、酵母菌4%（微生物实验室培养)和水。混合均匀后在30℃下厌氧发酵3 d，制成具有酒香味，酒精度为7～9°的新型饲料。其日粮组成及营养水平见表1。

表1 供试牛日粮组成及营养水平

2 试验方法

2.1 引物设计与合成

根据GenBank中（牛）的FABP4基因序列（序列号：NM_174314.2）、CAPN1基因序列（序列号：NM_174259.2）和β-actin基因序列（序列号：AB098930.1），按照实时荧光定量PCR引物设计原则，用Oligo6.0软件设计特异性引物。内参基因是β-actin基因，表2为引物信息（引物由上海生工生物技术有限公司合成）。

表2 实时荧光定量PCR引物

2.2 背最长肌组织总RNA提取

利用TaKaRa公司的总RNA提取试剂盒提取供试牛背最长肌中的总RNA，整个操作过程在超净工作台中进行，不能有RNA酶的污染。

2.3 总RNA的检验

提取总RNA样品4 μl，用DEPC处理水稀释250倍，混合均匀后，测定260、280 nm吸光度（利用紫外分光光度计），确定溶液的OD260/OD280值是否在1.8～2.0区间之内，然后计算总RNA的浓度。

总RNA的浓度(ng/ml)=OD260×稀释倍数×50/1 000。

取总RNA样品5 μl（约6～8 μg的RNA），进行凝胶电泳分离，利用凝胶成像仪观察总RNA条带数量、清晰度和有无拖尾现象，其中18S和28S的条带亮度比约为2∶1。……