毛炜翔，陈红兵

（1. 江西省标准化研究院，南昌 330029；2. 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，南昌 330047）

小麦过敏原α-醇溶蛋白在大肠杆菌中的表达

毛炜翔1，陈红兵2

（1. 江西省标准化研究院，南昌 330029；2. 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，南昌 330047）

小麦中α-醇溶蛋白是乳糜泻的主要致病抗原。本实验根据已报道的α-醇溶蛋白氨基酸序列，PCR法从郑麦9023中扩增出了α-醇溶蛋白基因。分别将α-醇溶蛋白基因克隆到 pMD19-T-Simple载体和pGEX-4T-1载体，经过PCR，酶切，测序鉴定，成功构建了克隆载体pMD19-T-α-gli和表达载体pGEX-4T-1-α-gli，将表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS，借助SDS-PAGE分析方法，成功得到了表达α-醇溶蛋白的大肠杆菌工程菌株。

小麦过敏；醇溶蛋白；分子克隆；表达

随着全球经济一体化和食品贸易国际化，食物过敏问题具有更大的潜在危险性，建立可靠、定量的过敏原检测方法对于确保食品标签的一致性和消费者的安全十分必要[1]。

我国作为小麦生产第一大国，长期以来也是小麦进口大国，年消费量在1亿吨以上[1]，小麦过敏成为一个不可忽视的食品安全问题[2]。然而因历史和研究水平的原因，我国对包括小麦过敏的基础研究投入严重不足，相关的过敏原检测技术和标准还是一片空白。

本实验拟从小麦品种“郑麦9023”（我国当前优质小麦品种种植面积第一位）中，克隆出小麦重要过敏原α-gliadin的基因，并探索α-gliadin的基因在大肠杆菌中的表达。通过本实验，将获得大量重组过敏原α-gliadin，为下一步工作奠定物质基础，如制备单克隆抗体或多克隆抗体、过敏原α-gliadin的表位定位以及乳糜泻病人体外诊断试剂的标准化[1]。同时，对于加快开展小麦过敏原检测技术方法和标准的研究，保障人民身心健康安全将具有重要的现实意义[3]。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

种子购自河南省郑州市场，E.coliDH5α本实验室保存，载体pMD19-T-Simple购自Takara（大连）有限公司，E.coli BL21（DE3）pLysS、载体pGEX-4T-1由南昌大学黄国俊博士惠赠。

1.2 主要酶与试剂

Taq DNA聚合酶购自Takara（大连）有限公司，限制性核酸内切酶EcoRI、BamHI购自MBI公司，T4连接酶购自Promega公司，分子量Marker、高纯度质粒小量提取试剂盒，PCR胶回收试剂盒购自TIANGen公司，其余试剂均为生化试剂或国产分析纯。

1.3 引物的设计与合成[1]

根据GenBank已报道的小麦α-gliadin的基因序列，设计好一对扩增引物，为了便于克隆与表达，在上游引物5'端引入了BamHI酶切位点，下游引物5'端引入了EcoRI酶切位点。为了使限制性内切酶能够有效识别酶切位点切断DNA，分别在上游引物和下游引物的5'端加入ACA和ACC保护性碱基（用带底纹字体表示）[1]。

上游引物

5'-ACAGGATCCGTTAGAGTTCCAGTG -3'（BamHI）下游引物

5'-ACCGAATTCTCAGTTGGTACCGAAG-3'（EcoRI）

引物由上海生物工程技术服务有限公司合成，酶切位点用斜体和下划线表示[1]。

1.4 α-gliadin基因的扩增

1.4.1 小麦基因组DNA的提取

以郑麦9023种子为材料，提取基因组DNA[4]。

1.4.2 α-gliadin基因的扩增

采用50μL反应体系，dNTP（2.5mmol/L each）2μl，缓冲液（10xBuffer）5μl，上下游引物（20μmol/L）各1μl，模板DNA1μl（100ng），0.5μL（2.5单位）Taq DNA聚合酶，用无菌水加至总体积为50μL。94℃预变性2min；循环过程，94℃变性lmin，52℃退火lmin，72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃延伸10分钟，4℃保存。

1.5 PCR扩增产物的回收

按照TIANGen普通型琼脂糖DNA回收试剂盒操作说明进行。

1.6 重组克隆质粒的构建

将回收的PCR产物与载体pMD19-T-Simple在T4DNA连接酶的作用下4℃连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布含Ampicillin、X-gal、IPTG的LB培养基，挑取经蓝白斑筛选的白色菌落，用TIANGen质粒小量提取试剂盒提取质粒，进行PCR、双酶切鉴定、测序，经鉴定的阳性重组克隆质粒命名为pMD19-T-α-gli[5]。

1.7 原核表达载体的构建

将pMD19-T-α-gli重组质粒和pGEX-4T-1载体分别用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切后回收，在T4DNA连接酶的作用下16℃连接15h，连接产物转化BL21（DE3）pLysS感受态细胞。挑选呈白色菌落的重组质粒，进行PCR[6]、双酶切及序列测定，将经鉴定的阳性重组质粒命名为pGEX-4T-1-α-gli。

1.8 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达

将重组质粒pGEX-4T-1-α-gli菌液划线于含有Amp的LB琼脂平板上，挑取单个菌落在含Amp（终浓度为100mg/L）的LB培养基中37℃振荡培养过夜。按1：50比例扩大振荡培养，待OD600值达到0.55-0.65时，加入IPTG（终浓度为1.0mmol/L）37℃振荡培养，另设未诱导的pGEX-4T-1-α-gli重组质粒菌作为阴性对照，37℃继续培养4h，各取出1mL菌液，然后于4℃ 12000rpm/min离心4min，收集上清，用PBS液悬浮沉淀。

1.9 SDS-PAGE电泳[7]

分别取经过上述方法处理过的样品10μL，加入等量2×SDS凝胶加样缓冲液，煮沸5min，冰浴2min，进行SDS-PAGE电泳（积层胶浓度为5%，分离胶为12%），电泳后，经考马斯亮兰染色，甲醇-冰乙酸脱色后，观察结果。通过Bio-Rad公司的成像系统Quantity One定量分析，对SDS-PAGE电泳的蛋白带进行扫描，分析表达产物占菌体总蛋白的相对含量。

2 结果与分析

2.1 小麦基因组DNA的提取

琼脂糖凝胶电泳结果表明（图1），可以看到小麦基因组DNA清晰的条带，可以以此为模板扩增目的基因α-gliadin。

图1 小麦基因组DNA电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis pattern of genomic DNA from wheat

2.2 α-gliadin基因的PCR

采用设计的引物，以基因组为模板进行PCR，扩增产物电泳（图2），在大约800bp的位置有特异片段，与预期的基因长度一致。

图2 α-gliadin基因的扩增Fig.2 The agrarose electrophoresis pattern of the target DNA by PCR amplification

2.3 重组克隆载体的PCR、双酶切鉴定和测序

以阳性克隆子为模板，进行PCR鉴定，PCR产物经凝胶电泳检测，结果在800bp左右有PCR产物（图3），证明为阳性克隆子。

提取阳性克隆子的质粒，分别用限制内切酶BamHI，EcoRI酶切，经凝胶电泳分析，酶切片段大小正确，证明克隆构建成功（图4）。

将上海生工测序结果与GenBank数据库进行同源性比较，同源性最高可达到100%，证明已克隆到正确的α-gliadin基因。

图3 pMD19-T-α-gli的PCR鉴定结果Fig.3 The agrarose electrophoresis pattern of pMD19-T-α-gli gene by PCR amplification of target clone in situ

图4 阳性克隆子的酶切鉴定Fig. 4 Agarose gel electrophoresis pattern of the digested plasmid DNA

2.4 重组表达载体的PCR、双酶切鉴定和测序

以pGEX-4T-1-α-gli质粒为模板，PCR扩增出800bp左右的条带（图5）；pGEX-4T-1-α-gli用BamHI，EcoRI双酶切后，也可得到约800bp左右的片段（图6）。通过PCR、酶切结果以及测序结果也表明，α-gliadin基因已被正确地插入到pGEX-4T-1表达载体中。

图5 pGEX-4T-1-α-gli的PCR鉴定结果Fig.5 Agarose gel electrophoresis pattern of the target gene of pGEX-4T-1-α-gli by PCR

图6 阳性克隆子的酶切鉴定Fig.6 Agarose gel electrophoresis pattern of the digested plasmid DNA

2.5 表达产物的SDS-PAGE检测分析

pGEX-4T-1载体为含有tac启动子以及Amp抗性基因的原核高效表达载体，PGEX-4T-1为融合表达载体，其本身表达GST Tag的蛋白，分子量大小为26 kD。所表达的目的蛋白的分子量为31 kD，因此重组融合蛋白的分子量应为57kD。

通过与未经诱导表达的菌液相比较，经IPTG诱导的E.coliBL21（DE3）pLysS出现特异蛋白条带，约为57Kd，目的蛋白大小和推测的结果相近（图7），说明α-gliadin蛋白得到表达。Quantity One定量分析，诱导表达4h时融合蛋白含量GST-α-gliadin达到菌体总蛋白35%左右。

图7 E.coliBL21（DE3）pLysS/pGEX-4T-1-α-gli的表达分析Fig.7 SDS-PAGE pattern of expression products of pGEX-4T-1-α-gli in BL21（DE3）pLysS induced by IPTG

3 讨论

通过对α-gliadin基因的测序及其蛋白的表达，将为下一步做制备多克隆抗体的工作奠定基础，证明重组蛋白是否具有与IgE抗体结合的能力，进一步探索重组蛋白和天然蛋白在免疫原性上的区别，以及将来为大量的乳糜泻病人体外诊断提供重组蛋白。

[1] 毛炜翔.小麦过敏原α-醇溶蛋白编码基因的分子克隆的研究[D].南昌:南昌大学.2008.

[2] Battais F, Pineau F, Popineau Y, et al. Food allergy to wheat: identification of immunoglobulin E and immunoglobulin G-binding proteins with sequential extracts and purified proteins from wheat flour[J]. Clin Exp Allergy, 2003, 33(7): 962-970.

[3] Biagi F, Zimmerl K, Thomas P. Is gliadin mispresented to the immune system in celiac disease? A hypothesis. [J]. Q J Med, 1999, 92(2): 119-122.

[4] McDonaldB A. Population genetics of plant pathogenic fungi[M]. Bioscience,1993.

[5] 吴乃虎.基因工程原理[M].北京:科学出版社,1999.

[6] 金冬雁译.分子克隆实验指南[M].北京:科学出版社,1992.

[7] 郝春燕,李建国,李雅轩.小麦醇溶蛋白基因克隆研究进展[J].首都师范大学学报(自然科学版),2006,27(2): 67-70.

Prokaryotic Expression of α-gliadin Allergen in Wheat

MAO Wei-xiang1, CHEN Hong-bing2
(1. Jiangxi Institute of Standardization, Nanchang 330029, China; 2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang 330047, China)

α-gliadin is the major allergen that leads to celiac diseases. The α-gliadin gene was amplified by PCR from Zhengmai 9023, then cloned to pMD 19-T simple vector. A expression vector pGEX-4T-1-α-gli was constructed by routine method, and was identified by PCR, double digestion and sequence analysis. The result showed it was constructed correctly. The expression vector was transformed into E.coliBL21（DE3）pLysS and inducted by IPTG. The result of SDS-PAGE showed it was successfully expressed as a GST fusion protein.

wheat allergy; gliadin; molecular cloning; gene expression

TS201.3

A

1672-6286(2016)8-0011-6

国家质检总局科研计划项目（2009QK230）。

毛炜翔（1983-），男，硕士，研究方向为食品质量安全与标准化。