李月玥（广州计量检测技术研究院，广州 510030）

ATP荧光检测仪校准方法研究

李月玥（广州计量检测技术研究院，广州 510030）

ATP荧光检测仪是现场水质污染及现场环境物体表面细菌负载的快速检测中逐渐普及的检验仪器，在卫生检测领域中起着重要作用。本文依据ATP荧光检测仪的工作原理，初步建立一套可靠的校准方法，并对其线性误差测量不确定度进行分析。

ATP荧光检测仪；校准方法；测量不确定度

在卫生学评价中，细菌污染检测是常规监测项目。目前，细菌定量检测通常采用琼脂平板计数法，由于其操作复杂，耗费时间长，很难满足HACCP(Hazard Analysis and Critical Control Point) 体系中微生物污染的在线监测[1]。20世纪80年代，英国首先研制ATP荧光检测系统，随后将其应用于检测微生物和食品残渣[2]。

1 ATP荧光检测仪工作原理

ATP荧光检测仪依据ATP生物发光法的基本原理，即荧光素在荧光素酶催化下，由ATP激活，使之与氧结合，在结合过程中发出荧光[3]。其反应如下图1所示。当反应中的荧光素-荧光素酶达到饱和反应量时，ATP含量与所释放的荧光光子量成正比。有研究表明，活细胞数量的对数值与ATP生物荧光值的对数值之间存在良好的线性关系[4]。因此，ATP荧光检测仪以相对荧光强度（relative light units，RLU）数值表示样品中ATP的总量，进而反映样品中活细胞数量。

2 校准方法分析

根据ATP荧光检测仪的性能和工作原理，认为测量线性误差及测量重复性是影响其分析结果的主要技术指标，必须进行校准确认。

通过实验发现，ATP荧光检测仪的测量结果受工作环境影响，特别是外界ATP干扰、环境温度，以及测样时间。因此，在测试时应符合实验室洁净无ATP存在，环境温度在（10 ～30）℃中某一设定温度值下，测样时间一致等条件。

根据实际情况，在仪器的量程范围内取4～5个测量点，使用无ATP超纯水和ATP纯度标准物质准确配置相应浓度的ATP标准样品溶液。各测量点取10μL进行检测，测样时间为30 s，重复测量3次，取平均值作为测量结果。按线性回归法求出标准曲线的斜率、截距和线性相关系数。按照公式（1）计算标准曲线测量中间点的误差，即为仪器的线性误差。

为了得到仪器的测量重复性，在满足测试条件的情况下，选取中间测量点重复测量6次（取样量为10μL，测样时间为30 s），计算测量结果的相对标准偏差RSD（%），即为仪器的测量重复性。计算公式如下：

3 线性误差测量不确定度分析

使用一台性能稳定，量程为（0.01～10.0） fmol的ATP荧光检测仪，取0.01fmol、0.5 fmol、1.0 fmol、2.0 fmol、5.0 fmol为测量点，采用上述方法进行校准。测量线性误差的校准数据如表1所示，测量重复性的校准数据如表2所示。

表1 测量线性误差的校准数据

表2 测量重复性的校准数据

3.1 数学模型

本文中线性误差的计算方法如公式（1）所示，其数学模型为：

方差：

灵敏系数：

则：

3.2 测量结果的不确定度分析

ATP标准物质的纯度≥ 98%，其相对扩展不确定度小于2%（k=2），在2.0 fmol含量下，标准溶液含量的标准不确定度为0.02fmol。

3）合成标准不确定度

4）扩展不确定度

在95%置信概率下取k=2，线性误差测量结果的扩展不确定度为：

4 结论

目前，关于ATP荧光检测仪的国家计量校准规范还未公布。本文根据ATP荧光检测仪的工作原理，提出其测量线性误差及测量重复性的校准方法，并分析了线性误差测量不确定度，对ATP荧光检测仪的计量校准具有重要的参考价值。

[1] Tanaka H, Shinji T, Sawada K, et al. Development and application of a bioluminescence ATP assay method for rapid detection of coliform bacteria[J]. Water Research, 1997, 31(8):1913-1918.

[2] Selan L, Berlutti F, Passariello C, et al. Reliability of a bioluminescence ATP assay for detection of bacteria[J]. Journal of Clinical Microbiology, 1992, 30(7):1739-42.

[3] Mcelroy WD, Deluca MA. Firefly and bacterial luminescence: basic science and applications[J]. Journal of Applied Biochemistry,1983, 5(3):197-209.

[4] 廖如燕,陈胤瑜,华志涛,等.ATP生物荧光检测法快速检测水细菌污染的评价[J].旅行医学科学,2011,(6):5-11.

Calibration Method for ATP Fluorescence Detector

LI Yue-yue
(Guangzhou Institute of Measurement and Testing Technology, Guangzhou 510030, China)

The application of ATP fluorescence detector is more and more universal for the water pollution detection and the bacteria load on the object surface on the spot. It plays an important role in hygiene examination. Areasonable calibration method on the principle of ATP biological fluorescence method is established, and the measuring uncertainty of the linear error is analyzed.

ATP fluorescence detector; calibration method; measurement uncertainty

TH744.16

A

1672-6286(2016)8-0046-4

李月玥（1988-），女，河北保定人。硕士，主要从事化学及生物类仪器计量检测工作和研究。