吴锦荣，李西君，刘世周，薄文文，王玉杰

（1.新疆阜丰生物科技有限公司，新疆乌鲁木齐830000；2.山东阜丰发酵有限公司，山东临沂276600）

L-异亮氨酸生产菌Corynebacterium glutamicum JHI3-156中突变酶TD1及AHAS1的初研究

吴锦荣1，李西君1，刘世周2，薄文文2，王玉杰2

（1.新疆阜丰生物科技有限公司，新疆乌鲁木齐830000；2.山东阜丰发酵有限公司，山东临沂276600）

苏氨酸脱水酶（TD）和乙酰羟基氨酸合酶（AHAS）是谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）合成L-异亮氨酸的关键酶。TD受L-异亮氨酸反馈抑制，AHAS受三支链氨基酸的反馈抑制。通过研究分析L-异亮氨生产菌C.glutamicum JHI3-156中突变型TD1及AHAS1，发现TD1有一个突变氨基酸，AHAS1有三个突变氨基酸；将TD，TD1，AHAS和AHAS1在Escherichia coli BL21(DE3)中过量表达，经提取纯化及酶活测定，发现相比野生型TD，突变型TD1体现较高的酶活水平，完全不再受L-异亮氨酸反馈抑制；相比野生型AHAS，突变型AHAS1对较高浓度的L-异亮氨酸更耐受。

突变型TD1；突变型AHAS1；酶活测定；L-异亮氨酸；抗反馈抑制

谷氨酸棒杆菌中，L-异亮氨酸合成代谢途径中苏氨酸脱水酶（TD）受L-异亮氨酸抑制[1]；乙酰羟基氨酸合酶（AHAS）受三支链氨基酸反馈抑制，且AHAS催化丙酮酸形成α-乙酰乳酸或者催化2-酮丁酸形成乙酰羟基丁酸（图1），此反应决定着相关代谢流到不同的终产物[2]。因此找寻具有抗反馈抑制能力的突变型TD及AHAS对L-异亮氨酸生产具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验菌株、质粒及引物

试验所用的菌株、质粒如表1，2所示，重组载体构建所需引物如表3所示。

1.2 培养基及培养条件

1.2.1 培养基

LB培养基：1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母提取物，用于E.coli DH5α和E.coli BL21（DE3）菌株的培养。

表1 菌株

表2 质粒

表3 引物

改良的LB培养基：1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母提取物，0.5%葡萄糖。……