赵岩，黄龙辉，李娟，孙兰超，李燕军,2,3，谢希贤,2,3，陈宁,2,3

（1.天津科技大学生物工程学院，天津300457；2.代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室，天津300457；3.天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室，天津300457）

谷氨酸棒杆菌代谢副产物对α-酮戊二酸积累的影响

赵岩1，黄龙辉1，李娟1，孙兰超1，李燕军1,2,3，谢希贤1,2,3，陈宁1,2,3

（1.天津科技大学生物工程学院，天津300457；2.代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室，天津300457；3.天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室，天津300457）

谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）中ldh基因编码乳酸脱氢酶，可以催化丙酮酸转化生成乳酸，ackA和pqo基因编码乙酸激酶和丙酮酸：醌氧化还原酶，可以催化丙酮酸转化为乙酸。为了研究这三个基因缺失对谷氨酸棒杆菌α-酮戊二酸积累的影响，以C. glutamicum GDK-10为出发菌株，通过重叠延伸PCR及同源重组技术分别构建ldh，pqo，ackA，pqo和ackA基因缺失突变株GDK-14，GDK-15，GDK-16，GDK-17。对出发菌及上述重组菌株进行发酵验证比较，发酵结果表明：ldh和pqo基因缺失菌株的α-酮戊二酸产量分别比出发菌降低了8.54%和27.9%，而ackA基因的缺失使α-酮戊二酸产量比出发菌提高了8.99%。

谷氨酸棒杆菌；基因缺失；α-酮戊二酸；乳酸；乙酸

α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid，α-KG）是TCA途径和氨基酸代谢的中间代谢物，作为谷氨酸、琥珀酸以及杂环类化合物的前体[1-2]，在重要化合物合成中起着重要作用。同时，α-KG作为一种多功能有机酸，在食品、医药、化工行业以及科学研究中都有广泛的应用[3-5]。α-KG制备方法主要有化学法和微生物发酵法两种。目前全球生产α-KG的主要方式是化学合成法，而微生物发酵法具有原料成本低、产品得率高、自动化程度高、劳动强度低和技术改进可能性大等优点，有望逐步取代化学合成法[6]。

从谷氨酸生产菌C.glutamicum GDK-9出发，敲除谷氨酸脱氢酶编码基因（gdh）构建了菌株GDK-10。该菌株发酵结果表明：谷氨酸含量大幅降低，α-KG的积累量明显增加，但在发酵过程中生成乙酸、乳酸等副产物。这些副产物对α-KG的积累和产品分离提纯产生不利影响。笔者通过分子生物学手段阻断乙酸和乳酸的合成途径，考察对α-KG积累的影响。乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase）是谷氨酸棒杆菌合成乳酸的关键酶，由ldh基因编码，在α-KG的生物合成过程中，使碳源流向乳酸从而削弱了流向α-KG的量。乙酸激酶（acetate kinase）和丙酮酸：醌氧化还原酶（pyruvate quinine oxidoreductase）在谷氨酸棒杆菌中催化丙酮酸向乙酸转化。因此，敲除ldh以增加流向谷氨酸的碳源，试图提高α-KG产量；敲除乙酸合成途径的基因，以解除抑制性副产物乙酸对α-KG发酵的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及质粒

菌株和质粒信息见表1。

表1 菌株及质粒

1.1.2 培养基及培养条件

LB培养基用于培养大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌。必要时加入终浓度50 μg/mL的卡那霉素。大肠杆菌培养温度为37℃，谷氨酸棒杆菌培养温度为32℃。

斜面/平皿培养基：牛肉膏8 g/L，NaCl 3 g/L，玉米浆150 mL，酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，琼脂条20 g/L，pH 7.0～7.2，121℃灭菌15 min。

种子培养基：葡萄糖30 g/L，玉米浆20 mL，豆粕水解液30 mL，MgSO4·7H2O 0.7 g/L，K2HPO4· 3H2O 3 g/L，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20 min。

发酵培养基：葡萄糖80 g/L，Na2HPO43 g/L， KCl 1.5 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，MnSO4·7H2O 10 mg，FeSO4·7H2O 10 mg，ZnSO410 mg，VB1，B3，B5，B1210 mg，VH 4 μg，豆粕水解液30 mL，谷氨酸钠4 g/L，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20 min。

1.1.3 酶与试剂

限制性内切酶Hind III，EcoR I，solution I，Taq DNA Polymerase，PCR产物纯化及胶回收试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.4 引物设计

为了克隆待敲除基因上下游同源臂片段，参考C.glutamicum ATCC13032基因组序列进行引物设计，如表2所示。

表2 引物

1.2 方法

1.2.1 重组质粒pK18mobsacB△ackA和pK18mobsacB△pqo的构建

以C.glutamicum GDK-10基因组DNA为模板，通过PCR获得ackA，pqo基因5′端片段及3′端片段，以PCR产物为模板通过重叠延伸PCR[7]获得ackA，pqo基因内双缺失的DNA片段dackA，dpqo。将dackA，dpqo片段分别与基因敲除载体pk18mobsacB连接。

1.2.2 重组质粒转化

将连接体系用CaCl2介导转化法转入E.coli DH5α感受态细胞，然后将其涂布于含有50 μg/ mL卡那霉素的抗性平板中，至于37℃恒温培养箱中倒置培养14～16 h。挑取单菌落接种至含有50 μg/mL卡那霉素的LB摇管中，37℃，200 r/min培养12 h，提取质粒进行酶切验证。

将重组质粒电转化C.glutamicum GDK-10感受态细胞，质粒经过一次交换整合至GDK-10基因组上，在卡那霉素抗性平板中筛选整合质粒的重组菌株，接种至含有10%蔗糖的LB摇管中，转接两代，再吸取适量菌液涂布至含有15%蔗糖的LB平板上，通过PCR方法鉴定筛选得到ldh，pqo，ackA，pqo和ackA基因缺失的突变株GDK-14，GDK-15，GDK-16，GDK-17。

2 结果与讨论

2.1 缺失乳酸合成途径对C.glutamicum积累α-KG的影响

以出发菌株GDK-10作为对照，通过7.5 L罐分批补料发酵，考察重组菌株GDK-14发酵产α-KG的情况，同时检测了发酵过程中菌体细胞干重（DCW）、耗糖量和α-KG的质量浓度，以及副产物琥珀酸、乙酸和乳酸的质量浓度，结果如图1及表3所示。

表3 GDK-10，GDK-14的α-KG补料分批发酵参数

由图1和表3可知：发酵14 h时出发菌株GDK-10达到最大生物量19.5 g/L，而菌株GDK-14的最大生物量为15.4 g/L，较出发菌株下降了20.85%，这可能是ldh的缺失导致代谢紊乱的结果；在发酵过程中并没有检测到乳酸，说明经过分子改造，已经阻断了副产物乳酸的合成途径；发酵30 h时，GDK-14产酸量为40.18 g/L，与出发菌株相比下降了8.54%；而单位菌体产酸量为3.34 g/g，与出发菌株相比提高了12.08%。

2.2 缺失乙酸合成途径对C.glutamicum积累α-KG的影响

以出发菌株GDK-10作为对照，通过7.5 L罐分批补料发酵，考察重组菌株GDK-15、GDK-16和GDK-17发酵产α-KG的情况，同时检测了发酵过程中菌体细胞干重（DCW）、耗糖量和α-KG的质量浓度，以及副产物琥珀酸、乙酸和乳酸的质量浓度，结果如图2和表4所示。

表4 GDK-10，GDK-15，GDK-16和GDK-17的α-KG补料分批发酵参数

由图2和表4可知：菌株GDK-15的最大生物量为15.88 g/L，较出发菌株下降了18.44%，这可能是因为pqo的缺失导致EMP途径代谢紊乱的结果；发酵液中乙酸质量浓度为9.14 g/L，较出发菌株仅下降了2.04%，而菌株GDK-16的乙酸质量浓度为4.87 g/L，较出发菌株下降了47.81%，由此说明ackA是合成乙酸的主要编码基因；GDK-15的产酸量为47.88 g/L，较出发菌株提高了8.99%，单位菌体产酸量为4.21 g/g，较出发菌株提高了41.28%，说明pqo的缺失，可以达到截断丙酮酸到乙酸的碳代谢流而增加α-KG产量的目的；而GDK-16的产酸量为31.94 g/L，单位菌体产酸量为2.29 g/g，与出发菌株相比分别下降了27.9%和23.15%，GDK-16虽然乙酸含量下降为4.87 g/L，但产量较出发菌株下降了14.57%，糖酸转化率没有明显的变化；GDK-17的产酸量为37.53 g/L，较GDK-10下降了14.57%。以上结果说明：乙酸合成途径可以产生菌体代谢和生长所需的还原力，缺失该途径后由于还原力的不足导致TCA循环增强，从而使得α-KG下游代谢过强，最终导致产量下降；此外，GDK-16和GDK-17的琥珀酸含量与出发菌株相比分别较少了49.78%和58.94%，这也反映出TCA循环的增强。

3 结论

为减少支路代谢流，降低副产物对α-KG积累以及下游提取的影响，敲除合成乳酸和乙酸的关键基因。发酵结果表明：缺失ldh基因后乳酸停止积累，但菌体的生长受到明显的抑制，同时产酸量有明显的下降，并不利于α-KG的积累；pqo的缺失导致菌体的最大生物量较出发菌株有明显下降，但总的产酸量和单位菌体产酸量都有明显的提高，可以达到增强合成α-KG的目的；而GDK-16和GDK-17虽然在发酵过程中的乙酸含量大幅降低，但其产酸量并没有因为支路代谢的阻断而提高，反而较出发菌株有明显的下降，说明ackA的缺失并不利于α-KG的积累。

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[2]WIREN M,PERMERT J,LARSSON J.Alpha-ketoglut-aratesupplemented enteral nutrition:Effects on postoperative nitrogen balance and muscle catabolism[J].Journal of nutrition,2002,18 (9):725-728.

[3]BARRETT D G,YOUSAF M N.Poly(triol α-ketoglutarate)as biodegradable,chemoselective,andmechanicallytunable elastomers[J].Journal of macromolecules,2008,41(17):6347-6352.

[4]AURICH A,SPECHT R,MÜLLER R A,et al.Microbiologically produced carboxylic acids used as building blocks in organic synthesis[J].Journalofreprogrammingmicrobialmetabolicpathways, 2012,64(64):391-423.

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[6]郭洪伟,堵国成,周景文,等.微生物发酵生α-酮戊二酸研究进展[J].生物工程学报,2013,29(2):141-152.

[7]阮红,BERNHARD E.谷氨酸棒杆菌基因缺失菌株的定点构建[J].微生物学报,2002,42(4):458-464.

（责任编辑：朱小惠）

Effects of metabolic byproducts on accumulation of α-ketoglutarate in Corynebacterium glutamicum

ZHAO Yan1,HUANG Longhui1,LI Juan1,SUN Lanchao1,LI Yanjun1,2,3,XIE Xixian1,2,3,CHEN Ning1,2,3
(1.College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China;
2.National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology,Tianjin 300457,China;
3.Tianjin Engineering Lab of Efficient and Green Amino Acid Manufacture,Tianjin 300457,China)

The ldh gene encodes lactic dehydrogenase in Corynebacterium glutamicum,which catalyzes the transformation of pyruvic acid into lactate.The ackA and pqo genes encode acetate kinase and pyruvate quinine oxidoreductase,respectively,which convert pyruvic acid into acetate. In order to investigate the effect of gene deletion on a-ketoglutarate(α-KG)accumulation,the C. glutamicum mutants GDK-14(△ldh),GDK-15(△pqo),GDK-16(△ackA),and GDK-17(△pqo△ackA)were constructed by SOE-PCR and homologous recombination.The fermentation experiments showed that compared to the parental strain CDK-10,the α-KG yield of strain GDK-14 and GDK-16 decreased by 8.54%and 27.9%,respectively,while it reached 47.88 g/L in strain GDK-15 with an increase of 8.99%.

Corynebacterium glutamicum;gene knockout;α-ketoglutarate;lactate;acetate

TQ922

A

1674-2214（2016）04-0215-05

2016-05-16

赵岩（1990—），男，河北张家口人，硕士研究生，研究方向为谷氨酸棒杆菌葡萄糖和木糖共利用代谢工程，E-mail：495107364@qq.com.