祁海燕 封继宏 李美凤 郑兆晔 刘 伟 苏景深 关 鹏 李云辉

天津中医药大学(天津300073)



肺宁颗粒对AECOPD大鼠肺组织肺保护作用和血清TLR4 、NF-κB、SOD水平的影响

祁海燕△封继宏▲李美凤▲郑兆晔▲刘 伟▲苏景深▲关 鹏▲李云辉

天津中医药大学(天津300073)

目的:观察肺宁颗粒对慢性阻塞性肺疾病(COPD)急性期模型大鼠肺组织病理及血清TLR4、NF-κB、SOD水平的影响，初步探索肺宁颗粒在COPD急性期的肺保护作用机制。方法：将60只雄性Wistar大鼠随机分为6组，组别设立为空白组、AECOPD模型组、肺宁颗粒低、中、高剂量组、抗生素干预组，成功建立AECOPD大鼠模型后，各干预组对应给予药物治疗，共计1周。治疗结束后观察肺组织病理，治疗第4天和第8天采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠血清TLR4 、NF-κB、SOD含量。结果：肺组织病理结果显示符合COPD病理性改变；肺宁颗粒各剂量组及抗生素干预组肺组织病变较前减轻，结果发现，第4天和第8天，AECOPD模型组大鼠血清中TLR4 、NF-κB水平较空白组升高，SOD水平较空白组降低，且具有统计学差异(P<0.05)；AECOPD大鼠各用药组血清中TLR4 、NF-κB水平较模型组降低，血清中SOD水平较模型组升高，且具有统计学差异(P<0.05)。NF-kB表达水平测定中，肺宁颗粒三个剂量组第4天和第8天前后比较，均有统计学差异(P<0.05)。TLR4表达水平测定中，第8天的肺宁颗粒高剂量组与低剂量组之间比较，具有统计学差异(P<0.05)。结论：肺宁颗粒一定程度上抑制AECOPD中TLR4和NF-κB因子的表达，且肺宁颗粒干预组SOD活性明显升高，肺宁颗粒对感染所致慢性阻塞性肺疾病急性加重模型大鼠肺损伤具有一定的保护作用。

慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)是COPD作为常见病和多发病而引起患者死亡的主要因素，作为一种急性起病的过程，对患者的生活质量、疾病进程造成了较为严重的影响。在急性期控制病情进展和减少发病次数成为了COPD研究中的重点。具有清热祛痰，镇咳平喘之效的肺宁颗粒(国药准字号Z22020825，主要成分：返魂草提取物)广泛应用于急、慢性肺内感染，本研究探讨肺宁颗粒应用于AECOPD大鼠模型的肺保护机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物 来源：华阜康生物科技股份有限公司(北京)，许可证号:SCXK(京)2009-0004。提供同批次SPF级Wistar雄性大鼠60只，体重(150±20)g，组别设立为：空白组、AECOPD模型组、返魂草低、中、高剂量组、抗生素干预组，每组10只。实验室内温控在18～22℃，湿度50%～60%。实验于适应性喂养1周后开始。

1.2 实验药品 药品来源：肺宁颗粒(国药准字号Z22020825)，规格：10g/袋。盐酸莫西沙星片(国药准字号J20100158)，规格：400mg/片。

1.3 实验菌种 标准菌株：肺炎链球菌(菌株号：ATC49719)，来源：天津临床检验中心。

1.4 实验试剂 弹性蛋白酶，美国Sigma公司(批号：Lot#SLBD0685v)；乙醚，天津市化学试剂厂(批号:Q/12HG5531-2007)；水合氯醛(使用时配制成10%浓度溶液)，天津化学试剂有限责任公司(批号:Q/12HB4319-2009)。多聚甲醛，天津化学试剂厂(批号:Q/12HG4108-2009)。

1.5AECOPD大鼠模型建立 将王东等人[3]有关COPD动物模型的造模方法予以改进，通过肺气肿模型和COPD急性期模型设计，建立本研究AECOPD大鼠模型如下。

1.5.1 肺气肿大鼠模型的建立过程和方法[4]: 首先将大鼠放入密封性能良好的上、下双层干燥玻璃瓶(直径为26～30cm)内的上层，乙醚溶液置于密封干燥玻璃瓶的下层，随即开始观察大鼠活动状态的变化以及程度。大鼠进入麻醉期可由以下具体表现判断：呼吸变慢，反应迟钝，四肢紧张度降低。等待并判断大鼠已确定进入麻醉期，快速将大鼠自密封玻璃瓶中取出，仰卧固定于操作台上(操作台预先设定好头高尾低30°位)，带固定过程完成后，使用本课题组自制圈套固定于大鼠上齿，采取适度下压的手法，等待大鼠口腔基本暴露于视野中，此时迅速将课题组自制喉镜片插入，同时适度上抬会厌部分，呼吸间待声门裂完全暴露在观察视野中，配合等待大鼠呼吸时声门开放的一瞬间，迅速将本课题组自制圆钝头弯钢针对准声门部，准确插入声门下约 1～1.5cm处，造模组大鼠均匀缓慢注入弹性蛋白酶溶液0.15ml(单位：7.7μ/mg)。空白组按照上述造模方法注入等量生理盐水0.15ml。待滴注完毕迅速拔出钢针，随后将大鼠适度直立摇动约15秒，使注入溶液尽可能均匀分布于造模大鼠的两肺。本造模过程每7天进行1次，共计3次。肺气肿大鼠模型建立完成之后，第2天起，使用上述操作方法于肺气肿大鼠气管内滴注肺炎链球菌琼脂悬液，构建AECOPD大鼠模型。操作滴入：0.15ml，细菌浓度：1×1012CFU/mL。肺炎链球菌琼脂悬液攻击造模1次。

1.6 给药方法 自从AECOPD模型建立成功后第2天起，参照等效剂量的方法，计算各给药组大鼠的每日灌胃量。设立如下：空白组：生理盐水2ml，每日1次，连续灌胃1周。AECOPD模型组：生理盐水2ml，每日1次，连续灌胃1周。肺宁颗粒低剂量组：由肺宁颗粒配制成0.12g/(kg·d)水溶液，每日1次，连续灌胃1周。肺宁颗粒中剂量组：由肺宁颗粒配制成0.36g/(kg·d)水溶液，1d1次，连续灌胃1周。肺宁颗粒高剂量组：由肺宁颗粒配制成1.08g/(kg·d)水溶液，1d1次，连续灌胃1周。抗生素组：由盐酸莫西沙星片配制成40mg/(kg·d)水溶液，1d1次。共计灌胃1周。

1.7 观察方法及观察指标 1.7.1 一般情况:观察并记录在整个模型建立和给药过程内，各组大鼠如行动状态、毛发光泽度和稀少程度、呼吸节律的改变、进食和饮水量等方面的变化，定期称重并完整记录体重信息，并在造模过程结束后完整记录各组大鼠死亡情况。

1.7.2 肺组织肉眼观察与光镜下观察:取材部位选取大鼠右肺组织，首先观察肺组织外观，后进行常规的固定、脱水、包埋、切片、HE染色等步骤，待上述步骤完成后于光镜下观察取材肺组织病理改变(图1)。

1.7.3 采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清中NF-κB、TLR4 、SOD的表达水平。

2 结 果

2.1 一般情况 空白组大鼠呼吸节律无明显变化，反应灵敏，活泼好动，饮食水基本正常。造模各组较空白组体型偏瘦，精神差，反应迟缓，活动量明显减少，部分大鼠拱背竖毛明显，呼吸较空白组明显急促。模型动物接种肺炎链球菌后死亡1只，其余组至取材未见死亡。

2.2 肺组织肉眼观察与光镜下观察 见图1。肉眼观察：模型组大鼠肺体积较空白组显示增大趋势，外观色泽苍白，可见肺泡融合形成肺大泡后的凹凸不平表面，肺部弹性明显减弱，剖胸后肺脏萎缩不明显，仍保持膨胀状态，空白对照组大鼠改变不明显。

空白组：肺泡结构完整并排列整齐，肺泡壁增厚不明显，未见明显炎细胞浸润，黏膜上皮结构完整。AECOPD模型组：肺泡结构明显被破坏，肺泡壁变薄和不同程度的断裂后，融合形成大小不等肺大泡，肺泡周围可见部分炎性细胞的浸润，支气管上皮细胞坏死、脱落，少量炎性细胞浸润改变侵及肺小血管管壁周围。肺宁颗粒三个剂量组：肺泡结构明显被破坏，肺泡腔部分增大，肺泡壁变薄破坏融合，部分形成肺大泡，程度较模型组为轻。肺泡周围仍可见少量炎性细胞浸润改变，支气管上皮细胞脱落程度较模型组减轻，肺宁颗粒三个剂量组肺泡结构与支气管破坏程度较模型组均有所减轻。抗生素干预组：可见肺泡结构被破坏程度较模型组为轻，同时可伴有不同程度肺泡壁变薄、肺泡腔增大，并融合形成少量肺大泡，与模型组相比，肺泡周围炎性细胞浸润较减轻，支气管上皮细胞部分脱落、坏死。

图1 AECOPD大鼠肺组织病理图

2.3 AECOPD大鼠血清ELISA测定TLR4、NF-κB、SOD水平 见表1、表2、表3。

表1 肺宁颗粒对AECOPD大鼠血清TLR4表达水平的影响(ng/ml)

表2 肺宁颗粒对AECOPD大鼠血清NF-kB表达水平的影响(ng/L)

表3 肺宁颗粒对AECOPD大鼠血清SOD表达水平的影响(U/ml)

结果发现，第4天和第8天，AECOPD模型组大鼠血清中NF-κB、TLR4 水平较空白组升高，SOD水平较空白组降低，且具有统计学差异(P<0.05)；AECOPD大鼠各用药组血清中TLR4 、NF-κB水平较模型组降低，血清中SOD水平较模型组升高，且具有统计学差异(P<0.05)。NF-kB表达水平测定中，肺宁颗粒三个剂量组第4天和第8天前后比较，均有统计学差异(P<0.05)。TLR4表达水平测定中，第8天的肺宁颗粒高剂量组与低剂量组之间比较，具有统计学差异(P<0.05)。

3 讨 论 COPD急性加重(AECOPD)是指一种急性起病的过程，常伴有喘息、胸闷，咳嗽加剧、痰量增加、痰液颜色和(或)黏度改变以及发热等症状，并需要进行或调整药物治疗方案[2]。本研究着重于炎症学说与氧化/抗氧化失衡学说，探讨AECOPD大鼠模型应用肺宁颗粒后相关因子的表达水平变化。

TLR4介导多种免疫防御反应，抑制免疫炎症的发生发展，增强气道组织细胞的固有免疫功能，并减轻各种内外源性病原体对机体本身的损害以保护机体[5]。在 AECOPD病程中，TLR4 参与炎症反应过程，且它的表达水平与病情进展且与病情严重程度有一定相关性。NF-κB 作为多功能核转录因子，是处于机体抗炎的核心地位的重要一员。当 COPD患病机体受到内源性和外源性病原体刺激，NF-κB可被迅速激活，并参与气道炎症加剧、气道重构等过程，其中气管和支气管壁多种炎性细胞浸润的亦可参与NF-κB的活化过程。

肺组织用以保护自身的途径，主要靠不同的抗氧化机制体现，故SOD常作为判定机体氧化应激的指标，氧化/抗氧化失衡学说常见表现之一为超氧化物歧化酶(SOD)活性下降。

本实验结果显示，肺宁颗粒一定程度上抑制AECOPD中TLR4和NF-κB因子的表达，减少COPD中肺组织炎症细胞聚集的程度，减轻气道上皮炎症反应和肺组织炎症损伤，进而保护肺功能。我们推测肺宁颗粒可能通过抗炎、抗氧化和调节免疫的作用使细菌导致感染造成的的氧化负荷减轻，减轻自由基对细胞的脂质过氧化损伤，同时通过抗氧化作用抑制TLR4 /NF-κB的激活，导致炎症因子水平的下调。

[1] 中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组.慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2013年修订版)[J].中华结核和呼吸杂志,2013,36(4):255-264.

[2] 慢性阻塞性肺疾病急性加重( AECOPD) 诊治专家组.慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)诊治中国专家共识( 草案) [J].中华哮喘杂志(电子版),2013，7(1):1-12.

[3] 王 东，王 瑛，刘又宁.流感嗜血杆菌致慢性阻塞性肺疾病急性发作动物模型的建立[J].中华老年多器官疾病杂志，2011,10(2):156-160.

[4] 封继宏,祁海燕,郑兆晔,等. 经硬式鼻腔镜气管内滴注化学制剂建立AECOPD动物模型[J]. 辽宁中医药大学学报,2015,17(11): 68-70.

[5] Takeda K,Akira S. Toll-like receptors in innate immunity [J]. IntImmunol,2005,17(1):1-14.

(收稿2016-07-05；修回2016-07-29)

肺疾病,慢性阻塞性/中医药疗法 @肺宁颗粒 大鼠 动物实验

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Adoi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.11.054

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