周晓俊 边 莹 李 莉 尚俊平 陕西中医药大学第二附属医院(咸阳 712000)



菖葛益智方对血管性认知功能障碍大鼠脑组织微血管内皮细胞occludin和claudin-5表达的影响*

周晓俊 边 莹 李 莉△尚俊平 陕西中医药大学第二附属医院(咸阳 712000)

目的：通过菖葛益智方对血管性认知功能障碍大鼠脑组织微血管内皮细胞occludin和claudin-5的表达影响，探讨菖葛益智方防治血管性认知障碍的分子机制。方法：采用双侧颈总动脉闭塞法，制备血管性认知障碍大鼠模型。所有大鼠共6组，正常对照组，模型组，假手术组，菖葛益智方大剂量组、菖葛益智方中剂量组、菖葛益智方小剂量组，每组10只。灌胃6周。检测大鼠脑组织微血管内皮细胞occludin和claudin-5的含量。结果：正常对照组occludin和claudin-5的表达丰富，模型组occludin和claudin-5表达明显减弱。菖葛益智方小剂量组与对照组相比，occludin、claudin-5表达没有明显改变；菖葛益智方大剂量组occludin、claudin-5的表达与对照组相比明显增加。结论：菖葛益智方可以促进occludin和claudin-5合成及表达，使血脑屏障的通透性得以降低。

血管性认知功能障碍(Vascular cognitive impairment,VCI)指由脑血管病或者脑血管因素引起的认知障碍，如果能够及早进行干预治疗，多数可以缓解病情进展，改善其临床症状[1]。缺血性卒中引起脑组织的缺血缺氧，导致的组织能量耗竭，从而启动并加重脑组织损伤[2]。脑功能的实现主要依靠神经细胞，近年来，神经细胞不可逆损伤机制是人们研究探索的热点，并因此产生较多的神经保护策略，但至今也没有一致认可的疗效显著的神经保护药物[3]。

菖葛益智方主要由石菖蒲、葛根、巴戟天、郁金、远志五味中药组成，前期临床研究发现菖葛益智方能明显改善血管性认知障碍患者中医证候，为进一步探讨其作用机制及药理作用,本研究进行了以下实验,为菖葛益智方的临床应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法 1.1 药品与试剂 菖葛益智方由石菖蒲、葛根、郁金、远志、巴戟天五味中药材组成。所有药材均购自陕西中药大学第二附属医院中药房，并经陕西中医药大学中药教研室鉴定。药物称好后，水煎制成混悬液，-4℃冰箱保存备用。SD大鼠购自西安交通大学医学院实验动物中心。occludin和claudin-5抗体购自Sigma-Aldrich(中国)公司。

1.2 实验分组 造模前将大鼠随机分成6组，分别为正常对照组，模型组，假手术组，菖葛益智方大剂量组、菖葛益智方中剂量组、菖葛益智方小剂量组，每组10只。

1.3 VCI大鼠模型的制备 清洁级Wistar雄性大鼠共计60只，全部大鼠于造模之前均行水迷宫测试，并且祛除先天愚型的大鼠。应用双侧颈总动脉闭塞法进行造模。具体方法为：应用10%的水合氯醛溶液，以400mg / kg 的量进行腹腔麻醉，然后取仰卧位，行颈部中切口，于显微镜下进行双侧颈总动脉分离，并进行永久性结扎。

1.4 给 药 灌胃量全部按体表面积法计算，按照SD大鼠160g等量于成人60kg，大鼠每日用药量等于每日成人药量×6.562/346.68，并以换算后的大鼠等效剂量作为小剂量组，其5倍剂量为中等剂量组，10倍量为大剂量组。所有大鼠从实验前1周开始，菖葛益智方组应用菖葛益智方药液灌胃，1d1次。模型组给予等剂量的NS灌胃，1d1次。

1.5 血脑屏障(BBB)的通透性渗出量检测 用生理盐水配制2%EB，以2mg/kg的总量静脉给药。每组大鼠均为8只，取材前24h由尾静脉缓慢注射2.5%EB。之后24h后取脑，应用生理盐水冲洗直至液体清澈，然后用滤纸吸干，并称其重量，而后浸泡于5 ml甲酰胺中，50摄氏度水浴中孵育72h，移出溶液，以2000转/min的速度离心5min，取上清。而后，在UV300紫外可见光分光光度计下，620nm波长处检测EB甲酞胺中的OD值，定量分析计算样本脑组织中EB的含量。纯甲酞胺溶液作为空白对照组。

1.6 用免疫组化法测定缺血脑组织微血管内皮细胞occludin和claudin-5的表达 应用水合氯醛将大鼠麻醉之后，沿着胸骨左缘剪开大鼠的胸腔，灌注预冷生理盐水，速度控制在每分钟10ml，待没有血污之后以每分钟5～10ml的速度滴注4%多聚甲醛，至250ml，断头取脑；将其放至于4%多聚甲醛后固定24h，依次放入浓度为15%、20%、30%的蔗糖溶液中进行脱水；OTC包埋，用冰冻切片机将其按冠状连续切成厚度为10μm的薄片，随之进行免疫组化染色。免疫组化结果应用Motic Images Advanced3.2图像分析系统采集照片，然后进行定量分析总结。

1.7 统计学方法 采用SPSS13.0软件包(SPSS Inc.Chicago,IL)处理数据，计量资料以Mean±SD表示，组间比较应用单因素方差分析，计数资料用率表示，采用χ2检验，P<0.05具有统计学意义。

2 结 果 2.1 血脑屏障的通透性渗出量结果 应用EB渗透性评估血脑屏障通透性的变化,发现各组大鼠在缺血0min、30min脑组织未见染蓝，60min呈现缺血部位的脑组织限局性蓝染，120min缺血部位脑组织蓝染较前明显加重；菖葛益智方大剂组大鼠在缺血60min、120min缺血部位的蓝染程度较对照组明显减轻。缺血脑组织EB含量变化(见表1)。在模型对照组内，缺血30min组与0min组比较，EB的含量差异无统计学差异；与缺血0min组比较，缺血60min组、120min组脑组织EB的含量均高于0min组，差异有统计学意义(P<0.01)。菖葛益智方大、中、小组0min组和30min组的脑组织EB含量与对照组0min组相比，差异无统计学差异,菖葛益智方的60min、120min组的EB量与对照组相比显著减少，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 缺血脑组织微血管内皮细胞occludin和claudin-5的表达 对照组occludin和claudin-5的表达丰富、连续(见图1)。模型组occludin和claudin-5表达明显减弱。菖葛益智方小剂量组与对照组缺血相比,occludin、claudin-5表达没有明显改变;菖葛益智方大和大剂量组occludin、claudin-5的表达与对照组相比明显增加。

表1 血脑屏障的通透性渗出量结果

A正常对照组;B 模型对照组;C 假手术组;D 菖葛益智方小剂量组;E 菖葛益智方中剂量组;F 菖葛益智方大剂量组

A正常对照组;B 模型对照组;C 假手术组;D 菖葛益智方小剂量组;E 菖葛益智方中剂量组;F 菖葛益智方大剂量组

3 讨 论 缺血性脑血管病的病理生理血改变主要原因为微血管内皮细胞损伤。本课题组经长期临床研究发现，血管性痴呆病因病机多因痰瘀互结，损伤脑络，闭阻心窍所致。菖葛益智方主要由石菖蒲、葛根、远志、郁金、巴戟天五味中药组成，方中石菖蒲具有祛风宣湿、理气活血之功效;葛根祛邪扶正之效;石菖蒲、葛根共为君药，共奏豁痰活血、祛邪扶正之功。远志具有安神益智，祛痰解郁之效;郁金具有行气解郁，凉血破瘀;远志、郁金为臣药，起到活血祛痰之效。巴戟天具有补肾助阳、强筋健骨之效，以之相佐，可兼治脏腑虚损，达到标本兼治的目的。据现代临床药理研究表明，石菖蒲在镇静、促进学习、认知、抗痴呆等方面具有一定的疗效[4]；葛根提取物葛根素能够增加缺血脑组织中氧浓度，从而促进血管性疾呆的学习、记忆功能的恢复[5]。郁金对缺血缺氧性小鼠的脑组织具有保护作用[6]；远志提取物能够提高机体的抗氧化能力[7]；巴戟天中巴戟素[8]可以增加脑内乙酰胆碱的合成、释放，记忆相关的神经通路的传导及神经递质的释放，能够提高痴呆大鼠的学习、记忆能力。菖葛益智方是基于对血管性痴呆病因病机认识的基础上研制成防治VaD的有效方剂，在前期临床发现，菖葛益智方能明显改善血VCI患者中医证候、行为能力以及认知能力，能起到显著阻断血管性损害[4]。但是，菖葛益智方发挥其防治血管性认知障碍的分子机制尚不明确。本研究采用血管性认知功能障碍大鼠模型，研究菖葛益智方对血管性认知功能障碍大鼠脑组织微血管内皮细胞occludin和claudin-5的表达的影响，以期阐明菖葛益智方是通过发挥其防治血管性认知障碍的分子机制。该研究表明，菖葛益智方可以促进occludin和claudin-5合成与表达,从而保护BBB的完整性,降低了BBB的通透性，体现出了中医药具有多层次、多靶点的整体优势,值得进一步进行研究。

[1] Erkinjuntti T.Diagnosis and management of vascular cognitive impairment and dementia[J].Neural Transm Suppl,2002,63:91-109.

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[3] Del Zopo GJ.The neurovascular unit in the setting ofstroke[J].J Intern Med,2010,267(2):l56-171.

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[5] 吴海琴,张 蓓,张桂莲,等.葛根素对血管性痴呆大鼠海马中低氧诱导因子-1α和红细胞生成素表达的影响[J].西安交通大学学报,2006,27(2):132.

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[7] 闫 明,李 萍.远志抗衰老作用研究[J].实用药物与临床,2006,13(1):22-23．

[8] 梁宏宇,吴 伟,陈宏花.巴戟素对血管性痴呆大鼠的行为学影响及其机制的探讨[J].当代医药卫生,2015,2(5):8-9.

(收稿2016-06-08；修回2016-07-02)

*陕西省教育厅专项科研计划项目(2013JK0832)

认知障碍/中医药疗法 @菖葛益智方 大鼠 动物实验

R743.9

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2016.11.051

△上海市宝山区中西医结合医院(上海201966)