黄 勇 吴国庆 窦一田 曹式丽 江西中医药大学附属医院(南昌330006)



肾苏Ⅳ干预嘌呤霉素肾病大鼠足细胞损伤的机制研究*

黄 勇 吴国庆 窦一田△曹式丽▲江西中医药大学附属医院(南昌330006)

目的：探讨中药复方肾苏Ⅳ干预嘌呤霉素(PAN)肾病大鼠足细胞损伤的机制。方法：采用单次颈静脉注射法建立PAN肾病大鼠足细胞损伤模型。将60只SD大鼠随机分为A组(对照组)，B组(模型组)、C组(肾苏Ⅳ低剂量组)、D组(肾苏Ⅳ中剂量组)及E组(肾苏Ⅳ高剂量组)，每组12只。治疗第1、2、3、4、6周末检测大鼠24h尿蛋白定量(24hUpro)及血清白蛋白(ALB)水平；第1、6周末分别处死6只大鼠留取肾脏组织，检测肾小球足细胞Nephrin、CD2AP的表达变化；电镜观察肾小球足细胞超微结构的改变。结果：第6周末，C、D、E组24hUpro水平均低于B组，P<0.05；C、D、E组ALB水平均高于B组，P<0.05。第6周末，C、D、E组Nephrin、CD2AP表达均高于B组，P<0.05。C、D、E组大鼠肾小球基底膜增厚及足突融合程度较B组均明显减轻。结论：肾苏Ⅳ可降低PAN肾病大鼠24hUpro，提高ALB水平，促进足细胞骨架结构的损伤修复，阻抑足细胞损伤。

“风湿扰肾”，“肾络失和”常为慢性肾脏病病程中的重要病理因素。本课题在既往关于“肾络病证”研究的基础上，提出益气祛风、养血和络法干预慢性肾脏病足细胞损伤的创新性思路，通过筛选具有疗效优势的中药复方“肾苏Ⅳ”对PAN肾病大鼠足细胞损伤模型进行干预。其旨在从创新发展的角度认识慢性肾脏病，进而提高中医药治疗疑难疾病的临床和研究水平。

1 材料与方法 1.1 实验动物及分组 60只雄性SD大鼠，北京华阜康生物科技股份有限公司提供，体重160～180g，SPF/VAF级，许可证号SCXK(京)2014-0004。随机分为A组(对照组)，B组(模型组)、C组(肾苏Ⅳ低剂量组)，D组(肾苏Ⅳ中剂量组)及E组(肾苏Ⅳ高剂量组)，每组12只。

1.2 PAN肾病大鼠模型制备 造模药物：嘌呤霉素(100mg/支，Lot. No. 419E042)，北京索来宝生物科技有限公司提供。采用单次颈静脉注射法建立PAN肾病大鼠模型，PAN剂量为10mg/100g体重。腹腔注射5%水合氯醛0.6ml/100g体重，取仰卧位固定，75%乙醇消毒、备皮，在颈部沿颈静脉方向切开2cm，分离皮下组织层，暴露颈静脉，经颈静脉注射PAN溶液，分层缝合切口。术后经腹腔给每只大鼠注射青霉素钾盐(10万U)溶液，连续3d。对照组颈静脉注射等剂量生理盐水。

1.3 治疗药物及给药方法 肾苏Ⅳ组成：生黄芪30g，青风藤、泽兰各15g，炒当归、汉防己、僵蚕、重楼各10g。上7味药共煎煮3次，浓缩成100ml汁液(1.00g生药/ml)，无菌装瓶密封，置于4℃冰箱保存备用。给药方法：造模后第1天起，D组灌服肾苏Ⅳ剂量为1.80ml/200(g·d)，C组为D组的1/2，E为D组的2倍，A、B组灌服生理盐水剂量为1.80ml/200(g·d)，共灌服6周。

1.4 实验试剂与设备 实验试剂：24hUpro、ALB检测试剂盒由德赛诊断系统(上海)有限公司提供；Nephrin 、CD2AP购于英国Abcam公司；HRP标记山羊抗兔、HRP标记兔抗山羊、HRP标记兔抗小鼠、HRP标记兔抗大鼠购于美国KPL公司。实验仪器：日本日立H-7500型透射电镜；图像采集系统(GATANORIUS830)。

1.5 标本采集 治疗第1、2、3、4、6周末代谢笼收集大鼠24h尿液并测量尿量；目内眦取血，离心10min(3000rm/min)，分离血清，-20℃保存待测。各组治疗第1、6周末分别处死6只大鼠，迅速打开腹腔，摘取肾脏，剥离肾包膜，4℃条件下，取部分肾脏皮质组织，制成1mm3组织块，置于4%戊二醛溶液固定，用于电镜检测。剩余肾组织迅速置于液氮中保存，后转移至-80℃冰箱保存待测。

1.6 观察指标 24hUpro、ALB；Western Blotting法检测肾小球足细胞Nephrin、CD2AP的表达变化；电镜观察肾小球足细胞形态改变。

1.7 统计学方法 实验结果应用SPSS16.0统计软件分析，各组实验数据以均数±标准差表示。组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 24h尿蛋白变化 第1周末，B、C、D、E组均明显高于A组，差异有统计学意义(P<0.05)；第3周始，C、D、E组均明显低于B组，差异有统计学意义(P<0.05)；第6周末，D、E组均明显低于C组，差异有统计学意义(P<0.05),详见表1。

2.2 血清白蛋白变化 第1周末，B、C、D、E组均低于A组，差异有统计学意义(P<0.05)；第4周始，C、D、E组均高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)；第6周末，D、E组均明显高于C组，差异有统计学意义(P<0.05),详见表2。

2.3 肾苏Ⅳ对PAN肾病大鼠足细胞Nephrin表达的影响 第1周末，B、C、D、E组均低于A组，差异有统计学意义(P<0.05)；第6周末：C、D、E组均高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)；E组与C组比较差异有统计学意义(P<0.05),详见表3及图1。

2.4 肾苏Ⅳ对PAN肾病大鼠足细胞CD2AP表达的影响 第1周末：B、C、D、E组均低于A组，差异有统计学意义(P<0.05)；第6周末：C、D、E组均高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)；D、E组与C组比较差异有统计学意义(P<0.05)，详见表4及图2。

表1 治疗第1、2、3、4、6周末24h尿蛋白定量变化(mg/24h)

表2 治疗第1、2、3、4、6周末血清白蛋白变化(g/L)

表3 肾苏Ⅳ对PAN肾病大鼠足细胞Nephrin表达的影响

表4 肾苏Ⅳ对PAN肾病大鼠足细胞CD2AP表达的影响

2.5 电镜观察肾苏Ⅳ对PAN肾病大鼠足细胞超微结构的影响 第6周末电镜检测结果，A组：肾小球足细胞足突排列均匀整齐；基底膜厚薄均匀一致；毛细血管内皮细胞正常；近曲小管结构亦正常。B组：肾小球足细胞足突明显增宽、融合成板片状，裂孔间隙消失；足突胞质肿胀；基底膜局部明显增厚；血管内皮细胞中度增生、融合，窗孔消失。C组：肾小球足突融合，裂孔间隙变窄；基底膜中度增厚；足突胞质轻度肿胀；血管内皮细胞中度增生。D组：肾小球基底膜轻度增厚；足突轻度融合；血管内皮细胞轻度增生。E组：肾小球基底膜轻度增厚；足突轻度融合；血管内皮细胞轻度增生，见图3。

注：A为对照组；B为模型组；C、D、E分别为中药低、中、高剂量组

3 讨 论 足细胞损伤是肾小球损伤的中心环节。MCD、FSGS、MN及DN的发生都与足细胞损伤密切相关[1]。当足细胞丢失10～20%时，肾小球损伤尚可修复；丢失20～40%时，将导致肾小球硬化；丢失超过50%时，肾小球滤过功能将严重受损，肾小球硬化而不可逆转[2]。故阻抑足细胞损伤是防治多种肾小球疾病的核心环节。肾脏病往往病程绵长，肾气虚弱是导致疾病慢性化的内在基础，湿浊、瘀血、热毒、外邪是疾病进程中虚实错杂的病理因素。其中“风湿扰肾”，“肾络失和”更是疾病复杂病理阶段的关键环节。我们前期围绕“肾小球固有细胞功能调节”、“肾脏血管损伤修复”等进行了大量的研究[3-4]。本研究系既往研究基础上，通过筛选具有疗效优势的中药复方“肾苏Ⅳ”对PAN肾病大鼠进行干预，以探讨肾苏Ⅳ阻抑足细胞损伤的机制。方中以生黄芪、炒当归益气养血，充养肾络；以汉防己、青风藤、僵蚕祛风胜湿，搜剔肾络风湿伏邪；以重楼、泽兰解毒通络；诸药协同以益气祛风、养血和络，促进肾络气血调和。

PAN诱导的足细胞损伤主要表现为足突融合成板片状，裂孔间隙消失，继而足细胞表型发生改变，发展至肾小球硬化[5]，是目前研究MCD和FSGS的理想动物模型。足细胞可通过构建肾小球滤过的分子和电荷屏障，分泌可溶性因子，协调裂孔隔膜内信号传递等作用维持肾小球滤过屏障功能的正常[6]。而这一切都要以完整的足细胞骨架结构为基础。Nephrin是位于肾小球裂孔隔膜的一种跨膜糖蛋白，属免疫球蛋白细胞黏附分子超家族[7]。电镜三维重构技术观察结果显示：相邻足突Nephrin分子胞外段通过嗜同性结合或嗜异性结合组成许多线形结构，构成足细胞裂孔隔膜[8]。Nephrin分子胞内段的酪氨酸残基磷酸化后可激活下游信号分子，形成足细胞内特有的信号转导通路，参与足细胞重要生理病理过程的调节[9]。Nephrin磷酸化程度的降低与蛋白尿的发生以及足细胞形态改变密切相关，进而导致肾小球通透性和足突形态发生改变，引发蛋白尿[10]。有研究提出Nephrin的检测可作为预测肾小球疾发展的指标[11]。CD2AP与Nephrin共同维护足细胞裂孔隔膜形态和功能的完整性[12]。CD2AP可结合黏附分子CD2，使CD2AP分子成簇，加强其在T细胞的抗原呈递细胞的接触面积，从而影响细胞骨架的极性[13]。研究发现FSGS及ESRD患者中存在CD2AP基因突变[14]。肾病综合征患者中CD2AP基因突变者表现为对激素依赖或激素抵抗[15]。CD2AP mRNA表达与24h蛋白尿定量、肾小球纤维化程度呈负相关，可作为评估肾小球病变程度及预后的重要指标[16]。

综上，如能有效调控Nephrin、CD2AP蛋白表达的平衡，或可阻抑足细胞病变的进展。本研究中，PAN诱导足细胞损伤第1周末，大鼠足细胞Nephrin、CD2AP表达均明显低于对照组，提示PAN肾病大鼠肾小球足细胞骨架结构受损。第6周末，肾苏Ⅳ治疗各组Nephrin、CD2AP表达均明显强于模型组，提示肾苏Ⅳ可有效修复PAN肾病大鼠足细胞骨架结构的损伤。结合实验中大鼠蛋白尿及足细胞超微结构的改变，可推测PAN肾病大鼠蛋白尿的出现与足细胞骨架结构的损伤密切相关，而通过促进足细胞骨架结构损伤的修复可有效降低尿蛋白的排泄，阻抑PAN肾病大鼠足细胞损伤。

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(收稿2016-07-18；修回2016-07-29)

*国家自然科学基金青年项目(81403333)

肾病/中医药疗法 嘌呤霉素 @复方肾苏Ⅳ 足细胞 大鼠 动物实验

R692

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2016.11.055

△天津中医药大学第一附属医院(天津300193)

▲通讯作者：天津中医药大学第一附属医院(天津300193)