林晓萍（福建医科大学附属第二医院呼吸内科泉州362000）

乙酰半胱氨酸抑制脂多糖诱导的人肺N C I-H 292细胞粘蛋白M U C 5AC表达△

林晓萍（福建医科大学附属第二医院呼吸内科泉州362000）

目的：研究乙酰半胱氨酸（NAC）对脂多糖（LPS）诱导的气道粘蛋白MUC5AC表达的调控作用并探讨可能的机制。方法：体外培养人气道上皮细胞NCI-H292，实验分为对照组、黏液高表达组（LPS组）及乙酰半胱氨酸干预组（NAC+LPS组），分别采用Real time PCR和Western blot方法检测NCI-H292细胞MUC5AC、Nrf2的mRNA含量及蛋白表达水平。结果：LPS刺激NCI-H292细胞表达MUC5AC，MUC5AC mRNA及蛋白表达分别增加7.169±1.785及1.473±0.098（P均<0.05）。NAC促进NCI-H292细胞Nrf2表达，抑制LPS诱导的MUC5AC表达（P<0.05），以30mM最为显著。结论：乙酰半胱氨酸通过促进Nrf2基因表达，抑制气道上皮细胞粘蛋白MUC5AC分泌。

乙酰半胱氨酸 粘蛋白 MUC5AC Nrf2信号通路

正常分泌的气道黏液具有保护气道、湿润空气等作用，但在吸烟、感染、氧化应激等多种致病因素作用下，可产生大量促分泌因子作用于分泌细胞，产生过量黏液[1]。气道黏液高分泌是慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘、支气管扩张症及肺囊性纤维化等慢性气道炎症性疾病的特征性病理生理改变和临床表现[2～3]。在临床实践中发现许多患者死于气道黏液高分泌导致的气道阻塞或窒息，因此深入探索气道黏液高分泌的发病机制及调控措施具有重要意义。2015年我国撰写了第一个《慢性气道炎症性疾病气道黏液高分泌管理的专家共识》[4]，指出祛痰治疗有助于减轻慢性气道炎症性疾病患者的气道狭窄，避免反复感染，延缓肺功能下降。目前临床常用的祛痰药物有愈创甘油醚、羧甲司坦、N-乙酰半胱氨酸、厄多司坦、氨溴索等，可能的作用机制各不相同[5]。其中，N-乙酰半胱氨酸是一种经典的抗氧化剂，可降低黏液的黏稠度，促进黏液排出[6]。但目前关于N-乙酰半胱胺酸下调气道黏液表达的具体调控机制尚不完全清楚。

气道黏液的主要成分是粘蛋白MUC5AC，多种刺激因子如香烟烟雾、细菌、卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯（PMA）等均可引起气道MUC5AC表达增高，铜绿假单胞菌是慢性气道炎症性疾病的常见病原菌，因此本研究使用铜绿假单胞菌的胞壁成分脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激人气道上皮细胞NCI-H292建立粘蛋白MUC5AC高表达模型，以探讨N-乙酰半胱氨酸在气道粘蛋白MUC5AC表达中的调控作用及可能的作用机制。

1　材料与方法

1.1主要材料：人气道上皮细胞NCI-H292株（购自中国科学院上海细胞库），RPMI-1640培养基及胎牛血清（购自Gibco）；N-乙酰半胱氨酸（购自sigma公司），RIPA细胞裂解液及BCA蛋白定量试剂盒（购自上海碧云天生物有限公司），Trizol（购自Invitrogen公司），逆转录试剂盒和Real time PCR试剂盒（均购自TARAKA公司），Real time PCR引物（由上海生工生物工程技术服务公司合成），鼠抗人MUC5AC单克隆抗体（购自Thermo公司），兔抗人Nrf2单克隆抗体（购自abcam公司），其余试剂均为国产分析纯。

1.2主要方法

1.2.1细胞培养：人气道上皮细胞NCI-H292使用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，每2～3d更换一次培养液，每4～5d以1∶3比例传代一次。

1.2.2实验分组：取对数生长期的NCI-H292细胞接种于6孔培养板，细胞总数5.0×105个/2mL，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，18～24h后细胞达90％左右融合时，换用无血清RPMI-1640培养基培养过夜。

实验分组：①对照组：无血清的RPMI-1640培养基中继续培养；②黏液高表达模型组：无血清培养基中分别加入不同浓度LPS分别干预24h，提取细胞总RNA，采用Q-PCR方法检测各组细胞MUC5AC mRNA的表达，挑选最佳干预浓度；③NAC干预组：细胞预先予不同浓度NAC（10～40uM）预处理30min后，加入LPS干预24h，提取细胞总RNA，采用Q-PCR方法检测各组细胞MUC5AC mRNA的表达，挑选NAC最佳干预浓度。各组均设3个复孔，继续培养24h后收集细胞进行检测，实验重复3次。

1.2.3Real-time PCR检测：采用TRIzol法提取细胞总RNA，通过分光光度计及琼脂糖凝胶电泳检测所提总RNA的浓度及完整性。取1μg总RNA，参照TAKARA PrimeScript逆转录试剂盒说明书，采用10μL反应体系，将RNA逆转录为cDNA。接着，采用20μL反应体系、使用SYBR实时荧光定量试剂盒进行扩增反应。使用GADPH作为内参照，采用2－ΔΔCt法确定靶基因的mRNA的相对表达量，以空白对照组作为矫正样本（引物序列详见表1）。

表1　实时荧光定量PCR的引物序列

1.2.4Western blot：用RIPA试剂盒提取细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，100℃10min致蛋白变性。经5％～10％聚丙烯酰胺的梯度SDS-PAGE电泳分离，后电转1～2h至PVDF膜上，经5％脱脂奶粉封闭1h，相应一抗4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2h，经化学发光法显影、曝光。以与内参照GADPH产物条带的比值作为相对含量，分析各条带灰度值。1.3统计学方法：采用SPSS17.0统计学软件进行数据分析，各组检测数据均以均数±标准差（±s）表示，组间均数比较采用独立样本t检验或单因素方差分析。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2　结果

2.1建立LPS诱导的气道粘蛋白MUC5AC高表达模型：使用2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL和20μg/mL PA-LPS干预NCI-H292细胞24h后，提取细胞总RNA，Real time PCR结果显示MUC5AC mRNA表达水平显著增高，以10μg/mL为著，MUC5AC mRNA表达量为对照组的（7.169±1.785）倍（P=0.026）（图1A），MUC5AC蛋白表达量为对照组的（1.473±0.098）倍（P= 0.014）（图1B）。

图1A：不同浓度LPS均可诱导NCI-H292细胞MUC5AC mRNA表达，以10μg/mL为著（*组P=0.010）；图1B：LPS可诱导NCI-H292细胞MUC5AC蛋白表达（P<0.05）。

2.2N-乙酰半胱氨酸抑制NCI-H292细胞粘蛋白MUC5AC表达：实验分为3组：对照组、黏液高表达组、NAC干预组。预先使用不同浓度（10～40mM）N-乙酰半胱氨酸预处理NCI-H292细胞30min后加LPS 10μg/mL刺激，24h后收集细胞总RNA和蛋白裂解液，分别应用Real time PCR和Western blot方法检测细胞MUC5AC的mRNA和蛋白水平。结果显示分别使用10mM、20mM、30mM和40mM的N-乙酰半胱氨酸预处理30min后，NCI-NCI-H292细胞MUC5AC mRNA表达量分别为3.372± 0.549（P=0.065）、3.052±1.125（P=0.018）、2.215±1.089（P= 0.015）、2.569±0.778（P=0.025）；30mM NAC组和10mM及20mM NAC组相比，P<0.05，40mM NAC组和30mM NAC组相比，P= 0.205，差异无统计学意义。综上所述，不同浓度NAC均能抑制LPS诱导的MUC5AC基因转录和蛋白表达，以30mM抑制效果最强（图2A）。图2B显示使用30mM NAC预处理后LPS诱导的MUC5AC蛋白表达量降低至0.856±0.109，与LPS刺激组MUC5AC表达量1.473±0.098相比P=0.035，差异有统计学意义。说明N-乙酰半胱氨酸能抑制LPS诱导的MUC5AC表达。

2A：不同浓度NAC均可抑制LPS诱导的MUC5AC mRNA表达，亦以30mM为甚（#组P=0.026、*组P=0.065、**组P= 0.018、***P=0.015、****P=0.025，****组与***组相比、P= 0.205，无显著差异）；2B：NAC可抑制LPS诱导的NCI-H292细胞MUC5AC蛋白表达（*组P<0.05）。

2.3N-乙酰半胱氨酸对Nrf2信号通路的影响：图3A显示分别使用10mM、20mM、30mM和40mM的N-乙酰半胱氨酸预处理30min后，NCI-NCI-H292细胞Nrf2 mRNA的表达量分别为2.083±0.274（P=0.023）、3.218±0.201（P=0.003）、3.599±0.142（p= 0.001）、3.416±0.045（P=0.00），与LPS诱导的黏液高表达组Nrf2 mRNA的表达量1.081±0.019相比，P值均<0.05，差异有统计学意义；NAC可以促进Nrf2 mRNA表达，且当剂量<30mM时，随着NAC剂量增加Nrf2 mRNA的表达量逐步增加（P< 0.05），当剂量>30mM时，随着NAC剂量增加Nrf2 mRNA的表达量与基础值相比是有增加、但和30mM比较数值有所下降，但无显著差异（P=0.177）。MUC5AC mRNA在10μg/mL LPS作用时，随着NAC促进Nrf2 mRNA表达的增加而有下降。且NAC剂量<30mM时，随着NAC干预剂量增加，Nrf2 mRNA表达增加、而MUC5AC mRNA表达下降（P<0.05）；当NAC剂量为40Mm（>30mM）时，MUC5AC mRNA表达较30Mm NAC组增加，而Nrf2 mRNA表达较30mM增加不明显。

图2B示NAC干预组Nrf2蛋白表达量为2.318±0.287，与LPS诱导的黏液高表达组Nrf2蛋白表达量1.288±0.088相比，P=0.034，结果说明N-乙酰半胱氨酸通过激活Nrf2发挥LPS诱导粘蛋白MUC5AC表达的作用。

3A不同浓度的NAC均可诱导NCI-H292细胞Nrf2 mRNA的表达，以30uM为甚，随着NAC浓度增加，Nrf2 mRNA表达量不再继续上升；3B：NAC诱导NCI-H292细胞Nrf2蛋白的表达（P<0.05）。

3　讨论

N-乙酰半胱氨酸是一种疗效较好的祛痰剂，含有活性巯基（-SH），可以打断黏液蛋白的双硫键，分解粘蛋白，降低痰液的黏稠度，同时还能增强黏液纤毛系统的生理转运能力，促进黏液排出[6]。本实验结果也表明，各浓度N-乙酰半胱氨酸均可抑制LPS诱导的粘蛋白MUC5AC表达，其中以30mM NAC组最明显。证实N-乙酰半胱氨酸能参与调控气道粘蛋白的表达。

研究表明N-乙酰半胱氨酸同时也是谷胱甘肽的前体，能够增加细胞内的GSH，通过激活Nrf2信号通路清除自由基、抗细胞凋亡[6]。核因子E2相关因子2（Nrf2）是细胞抗氧化应激反应中重要的转录因子之一，可以上调多种抗氧化酶，提高谷胱甘肽和超氧化物歧化酶等抗氧化物的表达水平，清除自由基等氧化物质，维持细胞内氧化还原平衡，发挥抗氧化、抗炎反应及其他细胞保护作用[7]。目前也有不少研究发现Nrf2信号通路参与调控香烟烟雾或中性粒细胞弹性蛋白酶诱导的气道粘蛋白MUC5AC表达[8～9]。N-乙酰半胱氨酸作为Nrf2的诱导剂，很有可能也是通过Nrf2信号通路发挥抑制黏液过表达作用。本研究通过分析不同剂量NAC干预下NCI-H292细胞Nrf2及MUC5AC mRNA表达的变化，研究Nrf2在NAC抑制粘蛋白MUC5AC表达中的作用。研究结果显示，不同剂量NAC均能促进NCIH292细胞Nrf2 mRNA表达。当NAC剂量<30mM时，随着NAC干预剂量增加，Nrf2 mRNA表达逐步增加、MUC5AC mRNA表达逐步下降（P<0.05），以30mM为著；继续增加NAC的浓度（> 30mM），NCI-NCI-H292细胞Nrf2 mRNA表达量增加不明显，而MUC5AC mRNA表达较30Mm NAC组增加。说明N-乙酰半胱氨酸通过Nrf2参与下调MUC5AC表达。

综上所述，本研究通过体外细胞实验首次揭示了N-乙酰半胱氨酸下调气道黏液分泌的可能调控机制，为N-乙酰半胱氨酸的临床应用提供了实验依据，具有一定的创新性。

[1]Fahy JV，Dickey BF.Airway mucus function and dysfunction. N Engl J Med，2010，363（23）：2233-2247.

[2]Curran DR，Cohn L.Advances in mucous cell metaplasia：a plug for mucus as a therapeutic focus in chronic airway disease. Am J Respir Cell Mol Biol，2010，42（3）：268-275.

[3]Rogers DF.Mucoactive agents for airway mucus hypersecretory diseases.Respir Care，2007，52（9）：1176-1193.

[4]慢性气道炎症性疾病气道黏液高分泌管理中国专家共识编写组.慢性气道炎症性疾病气道黏液高分泌管理中国专家共识[J].中华结核和呼吸杂志，2015，38（10）：723-729.

[5]Balsamo R，Lanata L，Egan CG.Mucoactive drugs.European Respiratory Review，2010，19（116）：127-133．

[6]Samuni Y，Goldstein S，Dean OM，et al.The chemistry and biological activities of N-acetylcysteine.Biochim Biophys Acta，2013，1830（8）：4117-4129.

[7]Lu MC，Ji JA，Jiang ZY，et al.The Keap1-Nrf2-ARE Pathway As a Potential Preventive and Therapeutic Target：An Update. Med Res Rev，2016，May 18.

[8]Ying YH，Lin XP，Zhou HB，et al.Nuclear erythroid 2 p45-related factor-2 Nrf2 ameliorates cigarette smoking-induced mucus overproduction in airway epithelium and mouse lungs.Microbes Infect，2014，16（10）：855-863.

[9]Qi L，Xiangdong Z，Hongmei Y，et al.Regulation of neutrophil elastase-induced MUC5AC expression by nuclear factor erythroid-2 related factor 2 in human airway epithelial cells.J Investig Med，2010，58（5）：730-736.

Role of N-acetylcysteine in the MUC5AC mucin production of NCI-NCI-H292 cells

Lin Xiaoping（Department of Respiratory Medicine，the Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Quanzhou 362000，China）

0bjective：To demonstrate the role and underlying mechanism of N-acetylcysteine（NAC）in the regulation of airway MUC5AC mucin expression in NCI-H292 cell line.Methods：NCI-H292 cells divided into three groups：the control group，the model group（LPS）and the intervention groups（NAC+LPS）.The intervention groups were pretreated with NAC for 30 min before exposure to LPS. The MUC5AC，Nrf2 mRNA levels were analyzed by Real time PCR，and protein production was assayed by Western blot.Results：Compared with the control group，expression of MUC5AC mucin was increased after being stimulated by LPS（P<0.05），but it was significantly inhibited by NAC（P<0.05）.Conclusion：N-acetylcysteine suppresses MUC5AC hypersecretion by Nrf2 signaling pathway.

N-acetylcysteine Mucus MUC5AC Nrf2 signaling pathway

R 363

B

1672-8351（2016）11-0122-03

△福建省自然科学基金资助（编号：2013J01289）；福建省卫生厅青年科研课题资助（编号：40935）；福建医科大学附属第二医院青年苗圃基金课题（编号：2012MP37）。