宋永周 刘会玲 马 维 童九辉 李 飞 孙淑芹

(河北医科大学第二医院骨科，河北 石家庄 050000)



抗骨增生胶囊含药血清对大鼠成骨细胞增殖、分化的影响※

宋永周 刘会玲 马 维△童九辉 李 飞1孙淑芹1

(河北医科大学第二医院骨科，河北 石家庄 050000)

目的 探讨抗骨增生胶囊含药血清对大鼠成骨细胞增殖、分化及骨保护蛋白(OPG)和核因子-кB受体活化子配体(RANKL)蛋白表达的影响。方法 采用中药血清药理学方法制备含抗骨增生胶囊大鼠血清。取乳鼠颅骨，利用复合胶原蛋白酶反复消化，离心，体外培养成骨细胞。加入不同浓度的抗骨增生胶囊含药血清进行干预，噻唑蓝(MTT)法检测中药血清对成骨细胞增殖的影响，测定碱性磷酸酶(ALP)活性，Western Blot检测OPG和RANKL蛋白表达。结果 成骨细胞经抗骨增生胶囊含药血清作用后，细胞的生长呈现不同程度的增殖，中、高剂量中药组在24、48、72 h均有明显的促进作用(P<0.01)，且呈剂量依赖性。低剂量中药组在24、48 h时与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，72 h时作用较强(P<0.05 )。除低剂量组培养24 h外，低、中、高剂量中药组培养24、48、72 h后，ALP分泌均呈不同程度增加，均有明显的促进作用(P<0.01)。成骨细胞经过抗骨增生胶囊含药血清低、中、高剂量作用72 h后，对比值进行统计分析，与空白对照组比较，OPG表达明显升高(P<0.01)，RANKL表达明显降低(P<0.01)。结论 抗骨增生胶囊含药血清可以促进成骨细胞的增值、分化，从而促进骨形成。

成骨细胞；碱性磷酸酶；细胞增殖；药物作用；中药疗法

骨质疏松症是以骨量减少，骨的微观结构退化为特征，致使骨的脆性增加，易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病[1-2]。近年来，大量的临床和实验研究证明，中医药治疗骨质疏松症具有良好的效果[3-8]。抗骨增生胶囊为江苏康缘药业股份有限公司生产的治疗骨关节疾病的中成药，由熟地黄、肉丛蓉、骨碎补、淫羊藿、鸡血藤、牛膝、狗脊、女贞子、莱菔子等药物组成的复方制剂。本实验采用血清药理学和体外培养成骨细胞的方法来观察抗骨增生胶囊含药血清对成骨细胞增殖及骨保护蛋白(OPG)和核因子-κB受体活化子配体(RANKL)蛋白表达的影响，以探讨其应用于防治骨质疏松症的效果及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 出生24 h内SD乳鼠10只，用于分离培养原代成骨细胞。体质量200 g左右SD大鼠40只，雌雄不拘，用于制备含药血清。由河北医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(冀)2013-1-003。

1.2 药品及试剂 抗骨增生胶囊(江苏康缘药业股份有限公司，国药准字Z10980006)，碱性磷酸酶(ALP)染色试剂盒(南京建成科技有限公司)，ALP测定试剂盒(南京建成科技有限公司)，复合胶原蛋白酶(Sigma公司)，胎牛血清(Sigma公司)，DMEM培养基(Sigma公司)，兔抗鼠OPG抗体(美国SANTA Cruz)，兔抗鼠RANKL抗体(美国SANTA Cruz)，FITC标记的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗体(美国Jackson Immuno Research公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 含药血清的制备 取40只SD大鼠，随机分为空白对照组及低、中、高剂量中药组，每组10只灌胃给药。低剂量按人日临床剂量，经人大鼠体表面积比值折算成相当于人临床等效用量1.16 g/100 g给药，中、高剂量中药组予低剂量的3倍和9倍给药，空白对照组予同等容积的0.9%氯化钠注射液[9]。连续给药12 d，末次给药后2 h戊巴比妥钠腹腔麻醉，腹主动脉采血，3 000 r/min离心10 min，分离血清后于56 ℃烤箱中灭活30 min，0.22 μm滤膜抽滤除菌，分装后-20 ℃低温保存备用。

1.3.2 成骨细胞的分离纯化和培养 取10只出生24 h内SD乳鼠，无菌条件下取头盖骨，将头盖骨切碎至1 mm×1 mm大小，复合胶原蛋白酶37 ℃振荡消化30 min，弃消化液，再次加入复合胶原蛋白酶37 ℃振荡消化90 min，离心，弃上清液后加入含10%胎牛血清DMEM培养液，制成细胞悬液，静置10 min，轻轻吸取上清液至另一培养瓶中，再静置10 min，将上清液计数后按2×105/mL接种于培养瓶中，37 ℃、5%CO2培养箱培养，每3 d换液1次。当细胞增殖至占据瓶底约80%表面时，进行传代。倒置相差显微镜每天观察细胞的形态特征及生长情况并摄片。

1.4 检测方法

1.4.1 成骨细胞的鉴定 取第3代细胞稀释成2×105/mL ，接种于孔底铺有无菌玻片的6孔板，待细胞长满后，采用重氮盐法进行ALP染色，对所培养的成骨细胞进行鉴定。

1.4.2 噻唑蓝(MTT)法检测中药血清对成骨细胞增殖的影响 取第3代对数生长期细胞，制成单细胞悬液，按1×104/mL密度接种于96孔培养板，每孔200 μL，37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。弃上清液，分别加入10%空白血清，低、中、高剂量中药血清培养基各200 μL，每组设6个复孔，继续培养24、48、72 h，分别每孔加5 mg/mL的MTT 20 μL，继续培养4 h，弃上清液，各孔加150 μL二甲基亚砜(DMSO)，震荡10 min，490 nm波长处测定吸光度值。重复3次。

1.4.3 ALP检测 取第3代对数生长期细胞，制成单细胞悬液，按1×104/mL密度接种于96孔培养板，每孔200 μL，37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。弃上清液，分别加入10%空白血清，低、中、高剂量中药血清培养基各200 μL，继续培养72 h，弃去培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗后，每孔加入100 μL 0．1%Triton X-100，超声裂解细胞，按ALP检测试剂盒说明书进行操作，分光光度计测定490 nm 波长的吸光光度值，计算ALP含量。

1.4.4 免疫印迹(Western blot)测定OPG及RANKL蛋白表达 取第3代对数生长期细胞，制成单细胞悬液，按1×104/mL密度接种于25 mL培养瓶中，待细胞贴壁后，分别加入10%空白血清，低、中、高剂量中药血清培养基，继续培养72 h，弃上清，加入4 ℃裂解缓冲液中，超声裂解细胞，在4 ℃的冰冻环境下14 000 r/min离心5 min。取上清液，二喹啉甲酸法(BCA)测定蛋白浓度。蛋白变性后上样，同时上Marker，电泳后进行转膜和封膜。分别采用封闭一抗(兔抗鼠OPG抗体、兔抗鼠RANKL抗体)和荧光二抗(FITC标记的山羊抗兔IgG抗体)，扫描并且记录各个条带的积分光密度值(IOD)。使用其与内参蛋白IOD的比值来反映目标蛋白的表达水平。

2 结 果

2.1 各组不同时间点成骨细胞增殖情况比较 见表1。

组 别n培养时间24h48h72h空白对照组60.103±0.0110.233±0.0350.406±0.025低剂量中药组60.195±0.0210.323±0.0390.598±0.040△中剂量中药组60.423±0.014*0.599±0.042*0.812±0.022*高剂量中药组60.639±0.036*0.828±0.030*0.960±0.035*

与空白对照组比较，*P<0.01，△P<0.05

由表1可见，成骨细胞经抗骨增生胶囊含药血清作用后，细胞的生长呈现不同程度的增殖，中、高剂量中药组在24、48、72 h均有明显的促进作用(P<0.01)，且呈剂量依赖性。低剂量中药组在24、48 h时与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，72 h时作用较强(P<0.05)。

2.2 各组不同时间点ALP活性水平比较 见表2。

与空白对照组比较，*P<0.01

由表2可见，除低剂量组培养24 h外，低、中、高剂量中药组培养24、48、72 h后，ALP分泌均呈不同程度增加，均有明显的促进作用(P<0.01)。2.3 成骨细胞的鉴定 刚接种的成骨细胞成球形,悬浮于培养液中并逐渐沉降贴壁展开，24 h后,大量细胞贴壁生长,呈长梭形、三角形或不规则多边形,并且有2～3个突起,胞质透亮、饱满，数量无明显增多。单核成卵圆形，1～3个核仁,胞质丰富、清晰。4 d后,细胞数明显增加,细胞周围有半透明光晕,胞浆内可见许多大小不一的深色颗粒散布核周,胞核椭圆居中,轮廓清晰；7～8 d后细胞融合成单层,细胞突起细长,细胞体积较前明显增大, 细胞铺满整个平皿底面, 细胞为梭形或立方块状，部分区域出现重叠生长(见图1)。ALP染色的细胞，细胞核呈深紫黑色或灰黑色圆形或椭圆形，染色较胞浆深，胞浆呈浅紫黑色，高倍镜下胞浆中见黑色颗粒,部分胞膜呈紫黑色线状染色，成骨细胞密集区有大量的棕黑色颗粒(见图2)。

图1 接种7 d的成骨细胞(×40)

图2 成骨细胞的ALP染色(×200)

2.4 各组OPG、RANKL蛋白的表达 见表3、图3。

组 别OPG/β-actinRANKL/β-actin空白对照组0.149±0.0370.428±0.041低剂量中药组0.223±0.030*0.327±0.028*中剂量中药组0.259±0.030*0.301±0.018*高剂量中药组0.403±0.036*0.252±0.025*

与空白对照组比较，*P<0.01

图3 各组别OPG、RANKL蛋白表达

由表3可见，成骨细胞经过抗骨增生胶囊含药血清低、中、高剂量作用72 h后，对比值进行统计分析，与空白对照组比较，OPG表达明显升高(P<0.01)，RANKL表达明显降低(P<0.01)。

3 讨 论

目前研究认为,骨质疏松症的发病机制主要是由于骨吸收和骨形成之间的平衡失调所致,其中成骨细胞在骨质疏松发病过程中起重要作用。中医学认为，“ 肾主骨生髓”，肾虚则髓减骨枯。大量的临床和实验研究证明补肾壮骨中药防治骨质疏松具有良好的效果[3-8]。抗骨增生胶囊由熟地黄、肉丛蓉、骨碎补、淫羊藿、鸡血藤、牛膝、狗脊、女贞子、莱菔子等药物组成。文献报道淫羊藿、地黄、骨碎补、肉丛蓉等对成骨细胞增殖及分化有促进作用，对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化也有促进作用，为中药防治骨质疏松提供了实验依据[9-12]。课题组在前期的研究成果中发现抗骨增生胶囊对骨折愈合的各个阶段均有促进作用，能够抑制白细胞介素lβ诱导的软骨细胞凋亡，降低基质金属蛋白酶13水平[13-15]。对于体外培养的成骨细胞增殖及分化，尚未见相关报道。

体外培养的成骨细胞具有与体内成骨细胞基本相同的生物学特性，能很好地反映成骨细胞的功能活动特点。ALP是成骨细胞分化和功能成熟的前期标志，是最常见的评价骨形成的指标。本研究采用复合胶原酶消化法分离培养乳鼠颅骨细胞，ALP染色呈阳性反应，说明本实验体外培养的就是成骨细胞，且具有典型的成骨细胞生物学特征。在本研究中，通过体外实验观察了各组含药血清对成骨细胞增殖、ALP活性的影响。研究结果表明，抗骨增生胶囊含药血清具有明显促进成骨细胞生长的分化增殖及ALP的分泌，且具有时间、浓度依赖性，对骨形成有促进作用。

OPG、RANKL和RANK 均为肿瘤坏死因子(TNF) 超家族成员[16]。成骨细胞可表达OPG与RANKL，二者严格控制着破骨细胞的分化，从而影响破骨细胞的形成和骨吸收。OPG是成骨细胞分化过程中产生的破骨细胞抑制因子，可作为饵受体与RANKL结合，从而阻断RANKL与破骨细胞表面的RANK结合，从而阻断骨吸收信号的传递，抑制破骨细胞的分化和成熟，诱导破骨细胞的凋亡。在本研究中，通过体外实验观察了各组含药血清对成骨细胞OPG、RANKL蛋白表达的影响。研究结果表明，不同浓度的抗骨增生胶囊含药血清均可增强OPG的表达，对RANKL的表达则有不同程度的抑制作用，与空白血清组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

总之，本实验发现抗骨增生胶囊含药血清能明显促进成骨细胞的分化增殖，促进ALP的分泌，促进成骨细胞OPG的表达，抑制RANKL的表达。因此，抗骨增生胶囊含药血清有可能通过促进成骨细胞OPG的表达，抑制RANKL的表达，进而通过阻断骨吸收信号的传递，阻止破骨细胞的激活、分化，从而达到抑制破骨细胞活性，并促进破骨细胞凋亡，达到治疗骨质疏松症的目的，具体机制还有待于进一步深入研究和探讨。本实验对于拓展其治疗范畴提供理论依据及实验基础。

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(本文编辑：董军杰)

Effects of medicated serum of Kanggu-zengsheng capsules on proliferation and differentiation of osteoblasts in rats

SongYongzhou*,LiuHuiling,MaWei,etal.

*DepartmentofOrthopedics,SecondHospitalAffiliatedtoHebeiMedicalUniversity,Hebei,Shijiazhuang050000

Objective To study the effects of medicated serum of Kanggu-zengsheng capsules on proliferation and differentiation of osteoblasts, and the expression of osteoprotegerin (OPG) and receptor activator of NF-кB ligand (RANKL). Methods The serum of rats administered Kanggu-zengsheng capsules was obtained by the method of serum pharmacology. The cranium of the rats were collected, then digested with compound collagenase repeatedly, and then centrifuged, in order to extract osteoblasts, which were fed with serum from Kanggu-zengsheng capsules at different doses. The proliferation of osteohlasts and the activity of alkaline phosphatase (ALP) were detected by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method. The expressions of osteoprotegrin (OPG) and RANKL were detected by Western Blot. Results There were different proliferation effects on the growth of osteoblasts after intervention. There were significant promoting effects at the time points of 24, 48 and 72 h in middle and high dose groups (P<0.01), with dose-dependent. There were no statistical differences on the effects at the time points of 24 and 48 h in low-dose group as compared with those in blank control group (P>0.05), and there were better effects at the time of 72 h (P<0.05). The secretions of ALP at 24, 48 and 72 h were enhanced at different degrees in low, middle and high dose groups (P<0.01), except the 24 h of low dose group. The expressions of OPG 72 h after intervention in low, middle and high dose groups were significantly increased as compared with those in blank control group (P<0.01), and the expressions of RANKL were lower (P<0.01). Conclusion The serum containing of Kanggu-zengsheng capsules can stimulate proliferation and differentiation of osteoblasts, then promote the bone formation.

Osteoblast; Alkaline phosphatase; Proliferation; Pharmacological action; Traditional Chinese herbs therapy

※ 项目来源：河北省医学科学研究重点课题(编号：20150666)

△ 通讯作者：河北医科大学第二医院骨科，河北 石家庄 050000

1 河北省定州市人民医院CT核磁科，河北 定州 073000

宋永周(1973—)，男，副教授，博士。研究方向：骨关节退行性疾病。

10.3969/j.issn.1002-2619.2016.08.017

R-332;R285.5;R329.24;R329.28;R681.053.1

A

1002-2619(2016)08-1187-05

2016-05-17)