苏保林 李 敬 陈刚毅

(广州中医药大学第一附属医院肾病科，广东 广州 510405)



强骨胶囊对糖尿病肾病患者维生素D-FGF23-Klotho蛋白内分泌轴及骨代谢指标的影响

苏保林 李 敬1陈刚毅

(广州中医药大学第一附属医院肾病科，广东 广州 510405)

目的 观察糖尿病肾病(DN)患者维生素D、成纤维细胞生长因子23(FGF23)、Klotho蛋白及相关骨代谢指标的变化，初步探讨强骨胶囊对慢性肾脏病骨矿物质代谢紊乱(CKD-MBD)的影响。方法 将DN-Ⅳ期患者75例随机分为2组。对照组37例予常规西医治疗，治疗组38例在对照组治疗基础上加用强骨胶囊治疗。治疗3个月后比较2组血肌酐(Cr)、钙(Ca)、磷(P)、钙磷乘积(Ca×P)、全段甲状旁腺激素(iPTH)、25-羟维生素D[25-(OH)D]、血清FGF23、Klotho蛋白、骨特异性碱性磷酸酶(BAP)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP5b)、骨密度(BMD)及T值，选取同时期我院体检中心的健康志愿者35例作为健康组。结果 治疗组、对照组治疗前Cr、P、Ca×P、iPTH、FGF23、BAP 、TRAP5b明显高于健康组(P<0.05)，校正Ca、25-(OH)D、Klotho蛋白、BMD、T值明显低于健康组(P<0.05)；2组治疗后FGF23、BAP、TRAP5b均较本组治疗前下降(P<0.05)，治疗组下降更明显(P<0.05)；2组治疗后Klotho蛋白、BMD、T值均较本组治疗前升高(P<0.05)，治疗组升高更明显(P<0.05)；治疗组治疗后校正Ca、Ca×P、25-(OH)D与本组治疗前比较明显升高(P<0.05)，对照组以上指标治疗前后差异无统计学意义(P>0.05)。Pearson相关性分析显示BMD与BAP、TRAP5b、FGF23呈负相关(P<0.05)，与Klotho蛋白、25-(OH)D呈正相关(P<0.05)，而与Cr、Ca、iPTH无相关性(P>0.05)。结论 强骨胶囊可以改善骨代谢，提高骨密度，增强骨矿化，其作用机制或许与影响维生素D-FGF23-Klotho蛋白内分泌轴有关。

糖尿病肾病；胶囊；中药疗法

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是全球性公共卫生问题，糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是DM主要微血管并发症，是引起终末期肾脏病(end-stage renal disease，ESRD)的主要原因之一。根据流行病学统计研究，预计到2030年，世界范围内的DM患者将达到3.66亿，而DN患者将超过1亿[1]。钙磷代谢紊乱是慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)特别是ESRD患者重要的并发症之一，近年来CKD骨矿物质代谢紊乱(CKD-mineral and bone disorder，CKD-MBD)成为研究热点。成纤维细胞生长因子23(FGF23)是近年发现的主要由成骨细胞分泌的重要内分泌因子，参与机体钙、磷及维生素D代谢的调节，形成维生素D-FGF23-Klotho蛋白内分泌轴。2015-05—2015-12，我们通过观察DN患者维生素D、FGF23、Klotho蛋白及相关骨代谢指标的变化初步探讨强骨胶囊对CKD-MBD的影响，结果如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取广州中医药大学第一附属医院肾病科门诊30例和住院45例，共75例患者，按随机数字表法分为2组。治疗组38例，男20例，女18例；年龄48～65岁，平均(57.28±7.42)岁；病程10～16年，平均(13.16±2.08)年；血红蛋白(Hgb)(100.53±7.19)g/L；糖化血红蛋白(HbA1c)(7.32±1.12)%；体质量指数(BMI)(21.07±2.06)；平均动脉压(MAP)(13.80±2.57)kPa。对照组37例，男19例，女18例；年龄50～67岁，平均(59.31±6.97)岁；病程11～16年，平均(12.97±2.33)年；Hgb(98.76±10.13)g/L； HbA1c(7.87±0.92)%；体质量指数(BMI)(20.74±2.72)；MAP(14.03±2.78)kPa。2组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。选取同时期我院体检中心的志愿者共35例作为健康组，经体格检查及实验室检查，综合评估排除心、脑、肝、肾、肺及内分泌等主要器官系统病变。其中男19例，女16例；年龄45～62岁，平均(51.88±9.92)岁。健康组性别、年龄分别与治疗组、对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2 病例选择

1.2.1 诊断标准

1.2.1.1 DM诊断标准 参考世界卫生组织(WHO)2011年标准[2]：有糖尿病症状(高血糖所导致的典型的症状，包括多尿、多饮、多食、不明原因的体质量下降、皮肤瘙痒及视力模糊等)，并且随机血糖(静脉血浆葡萄糖水平)≥11.1 mmol/L，或空腹血糖(静脉血浆葡萄糖水平)≥7.0 mmol/L，或葡萄糖负荷2 h血糖(静脉血浆葡萄糖水平)≥11.1 mmol/L。1.2.1.2 DN诊断标准 参考《中国2型糖尿病防治指南(2013年版)》[3]，符合以下任何一项可以考虑为DN：①大量白蛋白尿；②糖尿病视网膜病变伴微量白蛋白尿；③在10年以上糖尿病病程的1型糖尿病中出现微量白蛋白尿。以下情况应考虑非DN：糖尿病病程较短，单纯肾源性血尿或蛋白尿伴血尿，短期内肾功能迅速恶化，不伴视网膜病变，突然出现水肿和尿白蛋白排泄率≥300 mg/24h而肾功能正常，显著肾小管功能减退，合并明显的异常管型。鉴别困难时可通过肾穿刺病理检查进行鉴别。

1.2.2 纳入标准 ①诊断符合DN标准，且按照国际公认的1987年Mogensen分期[4]属于Ⅳ期患者；②知情同意者；③年龄18～65岁。

1.2.3 排除标准 ①进行血液透析或腹膜透析的患者；②合并感染、肿瘤、慢性肝病、心力衰竭、结核及酮症酸中毒患者；③服用免疫抑制剂或糖皮质激素患者；④正在或近3个月服用钙剂及维生素D类等影响骨代谢药物的患者；⑤妊娠患者。

1.3 治疗方法

1.3.1 对照组 予优质蛋白饮食(每日0.6～0.8 g/kg摄入蛋白质)，皮下注射胰岛素控制血糖(目标值空腹血糖6.0 mmol/L，餐后2 h 血糖8.0 mmol/L)，他汀类降脂药物调节血脂，钙拮抗剂，α、β-受体阻滞剂等控制血压[目标值18.00/13.33 kPa(135/85 mmHg)]，促红细胞生成素纠正贫血(血红蛋白目标值110 g/L)等基础治疗，不予钙剂及维生素D类等影响钙磷代谢的药物。

1.3.2 治疗组 在对照组治疗基础上加用强骨胶囊(北京岐黄制药有限公司，国药准字Z20030007，0.25 g×30粒/瓶) 1粒，每日3次口服。

1.3.3 健康组 不予特殊处理。

1.3.4 疗程 治疗组、对照组均治疗3个月后统计临床疗效。

1.4 观察指标 治疗组、对照组治疗前后分别采集空腹外周静脉血标本送至广州中医药大学第一附属医院检验科检测血肌酐(Cr)、糖化血红蛋白(HbA1c)、25-羟维生素D[25-(OH)D]、钙(Ca)、磷(P)、全段甲状旁腺激素(iPTH)；同时计算校正钙、钙磷乘积(Ca×P)。其中校正钙(mmol/L)=血清总钙(mmol/L)+0.8×(0.4-白蛋白浓度g/dL)。健康组入组时检测以上指标。

血清可溶性Klotho蛋白、FGF23、人骨特异性碱性磷酸酶(BAP)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP5b)测定：均采用酶联免疫吸附(ELISA)双抗体夹心法测定，试剂盒均购自上海盛唐生物科技有限公司。血清标本采集、试剂配置、操作步骤均严格按照说明书进行。

骨密度(BMD)测定：采用GE Medical Systems Prodigy双能X射线吸收仪(DXA)测量所有受试者第1～4腰椎，测得的BMD值均以g/cm2为单位，T值为与正常年轻成人(峰值骨量)比较值。根据WHO骨质疏松诊断标准[5]：T值≥-1.0为正常；-2.5

2 结 果

2.1 3组治疗前后生化指标比较 见表1。

表1 3组治疗前后生化指标比较 ±s

与健康组比较，*P<0.05；与本组治疗前比较，△P<0.05；与对照组治疗后比较，#P<0.05

由表1可见，治疗组、对照组治疗前Cr、P、Ca×P、iPTH明显高于健康组(P<0.05)，校正Ca、25-(OH)D明显低于健康组(P<0.05)；治疗组治疗后校正Ca、Ca×P、25-(OH)D与本组治疗前比较明显升高(P<0.05)；对照组各指标治疗前后比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 3组治疗前后相关指标比较 见表2。

表2 3组治疗前后相关指标比较 ±s

与健康组比较，*P<0.05；与本组治疗前比较，△P<0.05；与对照组治疗后比较，#P<0.05

由表2可见，治疗组、对照组治疗前FGF23、BAP、TRAP5b明显高于健康组(P<0.05)，Klotho蛋白、BMD、T值明显低于健康组(P<0.05)；2组治疗后FGF23、BAP、TRAP5b均较本组治疗前下降(P<0.05)，治疗组下降更明显(P<0.05)；2组治疗后Klotho蛋白、BMD、T值均较本组治疗前升高(P<0.05)，治疗组升高更明显(P<0.05)。

2.3 BMD与各指标的相关分析 以BMD作为自变量，行Pearson相关性分析显示DN患者BMD 水平与BAP、TRAP5b、FGF23呈负相关(r=-0.593，P<0.01；r=-0.601，P<0.05；r=-0.645，P<0.05)，与Klotho、25-(OH)D呈正相关(r=0.757，P<0.05；r=0.860，P<0.01)，而与Cr、Ca、iPTH无相关性(r=0.183，P>0.05；r=0.179，P>0.05；r=0.095，P>0.05)。见表3。

表3 DN患者BMD与各指标的相关性

3 讨 论

CKD-MBD是由于CKD患者钙磷代谢紊乱及长期透析继发的骨代谢活动异常，是CKD重要并发症之一，其不仅可导致骨骼损坏，严重降低患者的生活质量，而且还可以导致血管钙化及心血管事件的增加，影响CKD患者的预后。FGF23是一种由骨细胞和成骨细胞合成的具有内分泌功能的蛋白质，主要功能为抑制肾脏对磷酸盐的重吸收，促进尿磷排泄。现已证实，FGF23在骨—肾—甲状旁腺轴中起重要作用，参与调控骨矿物质代谢[6]。FGF23通过与靶组织上的成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptors，FGFRs)结合，进而激活下游信号通路，介导其生物学活性。FGF23与FGFRs结合时需要Klotho蛋白参与，Klotho蛋白是体内FGF23介导受体活化所必需的辅助因子[7]。

在钙磷代谢方面，越来越多的证据显示，在维生素D、FGF23及Klotho蛋白之间存在某种内在的相互联系，形成一个内分泌调节轴。正常情况下，由肾脏1α羟化酶催化合成的活性维生素D与维生素D受体相互作用下抑制肾素的生成。在肾素—血管紧张素—醛固酮(RAAS)系统不被激活的情况下，Klotho蛋白作为FGF23的辅助因子发挥正常功能，而FGF23作为1α羟化酶合成的负调节因子发挥正常的调节功能。某些异常情况下，由于1α羟化酶减少导致活性维生素D的合成减少，低水平的活性维生素D又使肾素生成增加，激活RAAS系统，导致Klotho蛋白表达减少，而Klotho蛋白又是FGF23发挥正常信号传导的重要因子，这样就引起FGF23水平升高。高水平的FGF23又抑制1α羟化酶的活性，进一步降低活性维生素D的水平。这样的反馈环就导致维生素D缺乏，RAAS系统激活，FGF23升高及肾脏分泌Klotho减少[8]。

现已证实，甲状旁腺组织表达Klotho蛋白和FGFRs。FGF23与甲状旁腺上的FGFRs-Klotho蛋白复合物结合，通过活化丝裂原活化蛋白激酶旁路发挥对甲状旁腺合成的调控作用[9]。在CKD透析患者血浆中FGF23水平明显升高，增高的FGF23与血磷和甲状旁腺激素(PTH)水平呈正相关[10]，CKD患者继发性甲状旁腺功能亢进的成因可能与FGF23-Klotho蛋白轴失衡密切相关。

BAP是成骨细胞分泌活动的标志物之一，分子量为80 kDa，主要在骨形成及矿化过程中发挥作用，肾功能减退和透析滤过不影响其血清浓度，易于检测，且研究表明与iPTH及骨组织形态学相关性较好[11]。当人体钙营养不良时血钙下降，iPTH上升，促进肾脏合成1，25(OH)2 D3，后者可使静止的成骨细胞转变成活动的成骨细胞，合成大量的BAP释放进入血液[12]。BAP能够快速、准确地评价体内钙的营养状况，可以早期反映骨转换改变。TRAP5b主要存在破骨细胞中，在成骨细胞含量较少。血液中的TRAP5b主要来源于骨吸收过程中破骨细胞的释放，在骨吸收的过程中,破骨细胞活跃并大量分泌TRAP5b。TRAP5b值越高，BMD值越低，骨质越疏松。TRAP5b可以作为较敏感的骨吸收指标，是反映破骨细胞活性和骨吸收状态的特异性指标[13]。

肾性骨病属中医学骨痹、骨痿范畴，其病因为年老体衰，肝肾亏虚，其病理特点是“本虚标实”。中医学认为，肾主骨生髓。《素问·阴阳应象大论》曰“肾生骨髓……在体为骨”，骨骼的生长、发育、修复，均需依赖肾脏精气的滋养和推动。强骨胶囊所含骨碎补为水龙科植物槲蕨的干燥根茎，其性温味苦，苦能泻能燥，温能通能散，入肾补骨，补中有行，行中有补，具有补肾强骨、养伤止痛之功效，在临床上广泛应用于肾虚腰痛、耳鸣耳聋、牙齿松动、跌仆闪挫、筋骨伤折等症[14]。现代药理研究显示，骨碎补提取物骨碎补总黄酮具有增加骨量，改善骨质量，维持骨微结构的完整程度，增强成骨细胞活性，促进成骨细胞分化与增殖，促进钙在骨的沉积，增强骨的矿化等作用[15]。

查阅文献，关于中成药对于DN患者维生素D-FGF23-Klotho蛋白内分泌轴的影响少有报道。本研究拟通过观察DN患者骨密度与维生素D-FGF23-Klotho蛋白内分泌轴及骨代谢指标的相关性，初步探讨中医中药对肾性骨病的调节作用。本研究中，我们发现与健康组比较，DN患者P、Ca×P、iPTH、FGF23、BAP、TRAP5b明显升高(P<0.05)，校正Ca、25-(OH)D、Klotho蛋白、BMD、T值明显降低(P<0.05)，说明DN患者存在严重的钙磷代谢紊乱及骨质疏松；经对症及强骨胶囊治疗3个月后，2组FGF23、BAP、TRAP5b均下降，且治疗组下降更明显(P<0.05)，Klotho蛋白、BMD、T值均升高，治疗组升高更明显(P<0.05)，行Pearson相关性分析显示DN患者BMD水平与BAP、TRAP5b、FGF23呈负相关，与Klotho蛋白、25-(OH)D呈正相关，而与Cr、Ca、iPTH无相关性。本研究提示强骨胶囊可以改善骨代谢，提高骨密度，增强骨矿化，推测其作用机制与影响维生素D-FGF23-Klotho蛋白内分泌轴有关，至于其具体作用途径则需通过进一步研究验证，为我们下一步深入研究CKD-MBD提供了思路。

[1] Reutens A T，Atkinstkins R C．Epidemiology of diabetic nephropathy[J]．Contrib Nephrol，2011，170(1):1-7．

[2] World Health Organization．Use of glycated hemoglobin (HbA1c) in the diagnosis of diabetes mellitus：abbreviated report of a WHO consultation[S]. Geneva,WHO,2011:1-25.

[3] Mogensen CE，Schmitz O.The diabetic kidney:from hyperfiltration and microalbum inuria to end-stage renal failure[J].Med Clin North Am,1988,72(6):1465 -1492.

[4] 中华医学会糖尿病学分会.中国2型糖尿病防治指南(2013年版)[J].中华内分泌代谢杂志，2014，30(10)：893-942.

[5] World Health Organization．Assesment of fracture risk and its application to screening for postmenopausal osteoporosis Report of World Health Organization Study Group[M]．Geneva,1994:61-63.

[6] 马春园，郝丽荣.FGF23-Klotho轴在慢性肾脏病骨矿物质代谢紊乱中的作用[J].医学综述，2015，21(7):1169-1172.

[7] Urakawa I,Yamazaki Y, Shimada T, et al．Klotho converts canonical FGF receptor into a specific receptor for FGF23[J]．Nature,2006,444(7120):770-774．

[8] Martin HB, Marc GV, Piet MW,et al. Cross talk between the renin-angiotensin-aldosterone system and vitamin D-FGF-23-klotho in chronic kidney disease[J].J Am Soc Nephrol,2011,22(9)：1603-1609.

[9] Ben Dov IZ，Galitzer H，Lavi-Moshayoff V，et al．The parathyroid is a target organ for FGF23 in rats[J]．J Clin Invest，2007，117(12)：4003-4008．

[10] Isakova T,Xie HL,Allison Barchi-Chung A,et al.Fibroblast Growth Factor 23 in Patients Undergoing Peritoneal Dialysis[J]．Clin J Am Soc Nephrol,2011,6(11)：2688-2695．

[11] 薛延，张海文，杨立红，等．血清骨特异性酸性磷酸酶的临床意义[J]．中华内分泌代谢杂志，2003，19(6)：466-467.

[12] 汪丙昂，李改丽，姚一民．伊班膦酸钠对高龄老年性骨质疏松症患者血清骨源性碱性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶表达的影响[J]．西部医学，2013，25(8)：1237-1241．

[13] A.Moghaddam，U.Muller，H.J.Roth，A.Wentzensen，P.A.Grutzner，G.Zimmermann TRACP 5b and CTX as osteological markers of delayed fracturehealing[J].Injury，2011，42：758-764.

[14] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010:121.

[15] Whiteside LA. Surgical technique: Transfer of the anterior portion of the gluteus maximus muscle for abductor deficiency of the hip [J]. Clin Orthop Relat Res,2012, 470(2):503-510.

(本文编辑：董军杰)

Effects of Qianggu capsule on Vitamin D- fibroblast growth factors 23- Klotho protein endocrine axis and bone metabolism in patients with diabetic nephropathy

SUBaolin*,LIJing,CHENGangyi.

*DepartmentofNephrology,FirstHospitalAffiliatedtoGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangdong,Guangzhou510405

Objective To observe the changes of Vitamin D, fibroblast growth factors 23 (FGF23), Klotho protein and bone metabolism indexes in patients with diabetic nephropathy (DN), and to preliminary study the effects of Qianggu capsule on chronic kidney disease bone mineral metabolism disorder (CKD-MBD). Methods 75 DN-Ⅳ patients were randomly divided into two groups. 37 cases in control group were treated by routine western medicine treatment, and 38 cases in treatment group were treated by Qianggu capsule on the basis of control group treatment. The serum creatinine (Cr), calcium (Ca), phosphorus (P), Ca×P, intact parathyroid hormone (iPTH), 25-hydroxy vitamin D[25-(OH)D], serum FGF23, Klotho protein, bone-specific alkaline phosphatase (BAP), tartrate-resistent acid phosphatase 5b (TRAP5b), bone mineral density (BMD) and T value after three months treatment were observed in two groups. 35 healthy volunteers were selected as healthy control group in our medical center at the same period. Results The Cr, P, Ca×P, iPTH, FGF23, BAP, TRAP5b before treatment in treatment and control groups were significant higher than those in healthy group (P<0.05), and the correction of Ca, 25-(OH) D, Klotho protein, BMD and T value were lower (P<0.05). The FGF23, BAP and TRAP5b after treatment were decreased in treatment and control group (P<0.05), and the decrease in treatment group was more significant (P<0.05). The Klotho protein, BMD and T value after treatment were increased in treatment and control group (P<0.05), and the increase in treatment group was more significant (P<0.05). The correction of Ca, Ca×P and 25-(OH) D after treatment were increased in treatment group (P<0.05), and there were no statistical differences on such indexes before and after treatment in control group (P>0.05). Pearson correlation analysis showed that a negative relation between BMD and BAP, TRAP5b, FGF23, respectively (P<0.05), and Klotho protein had positive correlation with 25-(OH) D (P<0.05) while there were no correlation with Scr, Ca and iPTH (P>0.05). Conclusion Qianggu capsule can improve bone metabolism, increase BMD, and enhance bone mineralization, the effects may be related with Vitamin D- FGF23- Klotho protein endocrine axis.

Capsule; Diabetic nephropathy; Traditional Chinese herbs therapy

1 华南师范大学医院内科，广东 广州 510631

苏保林(1980—)，男，主治中医师，硕士。从事慢性肾脏病的临床研究工作。

10.3969/j.issn.1002-2619.2016.08.005

R692.390.531

A

1002-2619(2016)08-1142-05

2016-01-16)