高向阳，高遒竹，张小燕，杨朋飞

（1.郑州科技学院食品科学与工程学院，河南郑州450064；2.江南大学食品学院，江苏无锡214122；3.河南农业大学食品科学技术学院，河南郑州450002）



检测分析

分子荧光法快速测定饲料中的金霉素

高向阳1，3*，高遒竹2，张小燕1，杨朋飞1

（1.郑州科技学院食品科学与工程学院，河南郑州450064；2.江南大学食品学院，江苏无锡214122；3.河南农业大学食品科学技术学院，河南郑州450002）

为快速测定饲料中金霉素含量，将实验样品采用超声波浸提后，用分子荧光法快速测定。结果表明，盐酸金霉素的最佳分析条件为：激发波长350 nm，发射波长421 nm，转化时间60 min，转化温度40℃，pH 11.50，超声温度60℃，超声功率160 W，料液比1∶50。工作曲线的回归方程为Y=798.32X+21.208，相关系数r=0.9996，检出限为0.544 ng/mL，定量限1.813 ng/mL；样品加标回收率为92.00%～103.83%，相对标准偏差（RSD）小于1%（n=11）。

金霉素；超声提取；碱性转化；分子荧光；饲料

金霉素可对多种病原菌起抑制作用，具有防治细菌性肠炎、萎缩性鼻炎和痢疾等作用（彭义杰等，2014；施杏芬等，2004）。人类长期食用含有抗生素的肉类或禽蛋后可在体内蓄积，会产生较强的毒副作用和耐药菌，导致抗生素药物效果变差或失效，致使病菌乘虚而入，严重者可造成死亡。此外，如果饲料中添加金霉素，则随畜禽粪便污染土壤和河流，严重威胁环境和食品安全。因此，建立快速、灵敏测定饲料中金霉素的方法，对食品安全检测、环境保护和人体健康，均有积极的现实意义。

目前，抗生素的测定方法主要有高效液相色谱法、紫外-可见分光光度法、毛细管电泳法、免疫分析法、薄层色谱法、液相色谱-质谱联用技术、化学发光法等（罗辉泰等，2015；张泽英，2013；李周敏等，2012）。分子荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、简便快速的优点。本实验采用超声辅助浸提方法浸提样品，建立了碱性介质中用分子荧光法测定饲料中金霉素的新方法。

1　材料与方法

1.1材料与试剂肉鸡饲料（浙江东立绿源饲料有限公司）；大猪复合预混料（郑州鼎盛饲料有限公司）；高档猪用浓缩饲料（郑州市嘉吉饲料有限公司）；肉用仔鸡中期配合饲料（郑州市兴发饲料有限公司）；仔猪配合饲料（郑州正大饲料有限公司）；高档猪用复合预混料（郑州市成农饲料有限公司）。

100μg/mL盐酸金霉素标准溶液（北京坛墨质检科技有限公司生产，批号：201412）；1.20 μg/mL pH 11.50盐酸金霉素标准溶液：取100 μg/mL盐酸金霉素标准溶液1.20 mL于100 mL容量瓶，调节pH为11.50后，用pH 11.50的氢氧化钠溶液定容。

碳酸氢钠（天津市科密欧化学试剂有限公司）；氢氧化钠（天津市德恩化学试剂有限公司）；盐酸（洛阳昊华化学试剂有限公司）。所用玻璃器皿在质量分数25%硝酸中浸泡6 h投入使用；所用水为二次重蒸水。

1.2仪器与设备970CRT荧光分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；雷磁PXSJ-216离子计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；DZKW-S-4电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）；KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SYZ-135石英亚沸高纯水蒸馏器（金坛市杰瑞尔电器有限公司）。

1.3方法

1.3.1标准曲线的绘制用1.20 μg/mL pH 11.50的盐酸金霉素标准溶液分别配制成0.00、0.06、0.12、0.24、0.48、1.20 μg/mL的梯度标准溶液，45℃恒温1 h，冷至室温，以350 nm波长激发，421 nm波长测定相对荧光强度，同时做空白实验。以浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.2样品中金霉素含量的测定称取0.30 g（准至0.0001 g）样品于25 mL容量瓶中，以料液比为1∶50的量加入pH 11.50的氢氧化钠溶液，160 W功率、60℃水浴超声30 min，冷至室温，用pH 11.50的氢氧化钠溶液定容、混匀，吸取上层液于离心管中，3000 r/min离心3 min，上清液在与标准曲线相同的条件下测定。按下式计算样品中金霉素的含量，同时进行空白实验。

式中：ω为样品中金霉素质量分数，mg/kg；25为样品定容体积，mL；478.88为金霉素的相对分子量；798.32为标准曲线的斜率；515.34为盐酸金霉素的相对分子量；m为取样量，g。

2　结果与分析

2.1最佳激发波长和发射波长的确定取1.20 μg/mL的盐酸金霉素标准溶液，固定发射波长为421 nm，激发光在200～800 nm扫描，结果如图1所示。

由图1可知，盐酸金霉素的最佳激发光波长为350 nm。

图1　盐酸金霉素激发光谱

固定激发波长为350 nm，荧光发射光谱在200～800nm范围内扫描，结果如图2所示。

图2　盐酸金霉素发射光谱

由图2可知，盐酸金霉素的最佳发射光波长为421 nm。

2.2盐酸金霉素标准溶液转化条件的优化

2.2.1酸度的影响吸取1.20 μg/mL标准溶液各2.00 mL于6个小烧杯中，分别调节其pH为7、8、9、10、11、12后，定量转入25 mL容量瓶中，50℃水浴锅中转化30 min，冷却至室温，分别用对应pH的氢氧化钠溶液定容，在完全相同的条件下测定其相对荧光值。结果表明同一浓度的盐酸金霉素溶液pH为11时荧光值最大。

2.2.2转化时间的选择准确量取1.20 μg/mL标准溶液各1.00 mL于5个小烧杯中，调节pH为11，于45℃恒温水浴锅中分别转化20、40、60、80、120 min，冷却至室温后定量转入25 mL容量瓶中，用pH 11的氢氧化钠溶液定容。在完全相同的条件下测定其相对荧光值，结果表明最佳转化时间为60 min。

2.2.3转化温度的选择准确量取1.20 μg/mL标准溶液各1.00 mL于7个小烧杯中，调节pH为11，分别在30、40、50、60、70、80、90℃的恒温水浴锅中转化30min，冷却至室温后定量转入25 mL容量瓶中，分别测定其相对荧光值，结果表明转化温度取40℃较为合适。

2.2.4正交实验在单因素实验结果的基础上，分别设置转化pH为10.50、11.00、11.50三个水平；转化时间55、60、65 min三个水平；转化温度35、40、45℃三个水平。采用L9（33）正交实验对标准溶液转化条件进行优化，结果如表1所示。

表1　正交实验设计结果

由表1可知，各因素影响转化效果的大小顺序为C＞A＞B，即转化时间＞温度＞pH，最佳转化条件组合为A2B3C2，即温度40℃、pH 11.50、时间60 min下测定的相对荧光值灵敏度最高。

2.3工作曲线与相关系数按1.3.1方法绘制工作曲线，结果如图3所示。

图3　盐酸金霉素的标准曲线

由图3可知，标准工作曲线的线性方程为：Y=798.32X+21.208，R2=0.9992，相关系数r=0.9996。盐酸金霉素为0.006～1.20 μg/mL时与相对荧光值呈良好线性关系。

2.4超声功率的选择设定超声功率为80～200 W进行研究，结果表明功率为160 W时荧光值达到最大。

2.5超声温度的选择准确称取肉用仔鸡中期配合饲料各0.5000 g于6个25.00 mL容量瓶中，用pH为11.50的氢氧化钠溶液定容。分别在30、 40、50、60、70、80℃水浴中提取30 min。3000 r/min离心3 min后取上清液测定，结果表明超声温度60℃测定信号达到峰值。

2.6料液比的选择准确称取肉用仔鸡中期配合饲料各1.0000 g于7个100 mL容量瓶中，设定料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70，加入pH为11.50的氢氧化钠溶液，50℃水浴超声提取30 min，3000 r/min离心3 min后取上清液测定，结果表明料液比选择为1∶40时，金霉素相对荧光值最大。

2.7超声提取条件的正交实验优化为优化最佳提取条件，在单因素实验基础上，取肉用仔鸡中期配合饲料0.4000 g，选择超声温度、超声功率及料液比做L9（33）正交实验，结果如表2所示。

表2　超声提取正交实验结果

由表2可知，影响金霉素提取效率的各因素大小顺序为C＞A＞B，即料液比＞超声功率＞水浴温度。最佳组合为A2B2C3，即在超声功率为160 W、60℃及料液比为1∶50时样品提取效率最高。

2.8回收率按实验方法操作，并添加标准金霉素溶液进行回收率实验，结果如表3所示。

由表3可知，样品加标回收率实验结果较为理想。

2.9检出限和定量限对空白样进行11次平行测定，按3倍标准偏差计算的检出限为0.544 ng/mL，按10倍标准偏差计算的定量限为1.813 ng/mL。

表3　回收率测定结果

2.10样品测定结果及精密度对样品进行11次平行测定，检验无可疑值后，取平均值报告，结果如表4所示。

表4　样品测定结果

参照农业部《饲料药物添加剂使用规范》（农业部公告第168号，2001）对猪饲料及鸡饲料金霉素含量的规定。各饲料样品中金霉素含量均未超过规定值，平行测定的相对标准偏差RSD＜1%。

3　结论

研究结果表明，盐酸金霉素溶液的pH为11.50，40℃下转化60 min为最佳转化条件；超声提取功率为160 W，温度为60℃，料液比为1∶50时饲料样品中金霉素的提取效果最佳；标准曲线的回归方程为Y=798.32X+21.208，相关系数r=0.9996，检出限为0.544 ng/mL，定量限为1.813 ng/mL，相对标准偏差RSD＜1%，加标回收率结果令人满意。所测定饲料样品本底中均含有金霉素，但未超过国家规定值。该法操作简单，省试剂、快速方便、精密度高，100 min左右可完成6个样品的测定，适用于批量饲料样品中金霉素的日常快速检测，有一定科学参考价值和推广应用价值。

［1］李周敏，方惠群，许丹科.牛奶中残留抗生素免疫检测方法研究进展［J］.生物技术通报，2012，28（11）：66～72.

［2］罗辉泰，黄晓兰，吴惠勤，等.分散固相萃取/高效液相色谱-串联质谱法快速测定饲料中87种药物残留［J］.分析测试学报，2015，34（9）：979～985.

［3］彭义杰，刘木华，赵进辉，等.蛋清中金霉素残留的银胶表面增强Eu（III）的荧光检测［J］.激光与光电子学进展，2014，40（2）：217～222.

［4］施杏芬，金海丽，周文海，等.高效液相色谱法测定饲料中的金霉素含量［J］.中国饲料，2004，1：34～34.

［5］张洋英.酶联免疫分析技术在兽药残留检测中的应用［J］.湖北畜牧兽医，2013，34（10）：59～61.

In order to develop the rapid determination of chlortetracycline content in feed，the samples were determined by molecular fluorescence spectrometry after extraction with ultrasonic technology.The results showed that the optimal excitation wavelength was 350 nm for chlortetracycline hydrochloride，emission wavelength was 421 nm，the conversion time was 60 min，transformation temperature was 40℃，pH was 11.50，ultrasonic temperature was 60℃，ultrasonic power was 160 W and the material liquid ratio was 1∶50.The regression equation of work curve was Y=798.32+21.208X，the linear correlation coefficient（r）equalled 0.9996，detection limit was 0.544 ng/mL，quantitative limit was 1.813 ng/mL.The standard addition recovery rate was between 92.00%and 103.83%，and relative standard deviation（RSD）was less than 1%（n=11）.

chlortetracycline；ultrasonic extraction；alkaline conversion；molecular fluorescence；feed

S816.17

A

1004-3314（2016）05-0029-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160507

郑州市科技局新兴产业研究与开发基金资助（153PXXCY186）