康小龙,吕晓静,黄清媚,熊春江,林蒋海,肖文娟,刘泽寰

(暨南大学 生命科学技术学院，生命与健康工程研究院分子生物研究中心，广东 广州，510632 )



黄曲霉寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在工业酿酒酵母CICC1346中的表达

康小龙,吕晓静,黄清媚,熊春江,林蒋海,肖文娟,刘泽寰*

(暨南大学 生命科学技术学院，生命与健康工程研究院分子生物研究中心，广东 广州，510632 )

通过重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension,SOE-PCR)扩增黄曲霉寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因和酿酒酵母α-信号肽序列，定向重组到整合型表达载体pδRCMB中，并在CICC1346中实现分泌表达；然后通过同源建模、利用分子模拟软件Discovery Studio 4.1分析其蛋白结构，以对硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷(pNPG)为底物，建立并确定酶活反应条件，并进行纯化、酶学性质分析；将密码子优化后序列在CICC1346中实现分泌表达，利用淀粉进行共发酵实验。结果显示：重组酶突变后相对野生型蛋白结构无影响。SDS-PAGE分析重组重组酶大小约为70 kDa；优化后最高酶活达到0.69 U/mL，重组酶最适pH为6.5，在pH4.5.0～7.0维持90%以上的酶活；最适温度为40 ℃，在30～40 ℃维持接近100%的酶活；受Cu2+和Mn2+严格抑制；寡聚-1,6-葡萄糖苷酶与α-淀粉酶及糖化酶协同利用淀粉产乙醇，提高淀粉水解效率。这是首次报道黄曲霉的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因在酿酒酵母整合型分泌表达。

酿酒酵母；黄曲霉；重叠延伸PCR(splicing by overlap extension,SOE-PCR)；同源建模；寡聚-1,6-葡萄糖苷酶；淀粉

淀粉是由葡萄糖为基本单位聚合而成的多糖，是自然界中含量最丰富的碳水化合物之一。淀粉链主要由α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键连接葡萄糖单元而成。其中，α-1,6-糖苷键只占总糖苷键很少比例,却是淀粉链形成分支结构的关键。……