朱海振　郑召鹏　江飞龙　韩静　李雪涛　陈光朋　李杭　陈正堂



·论著·

基于分子信标技术对活细胞内miR-155检测用于肺癌诊断

朱海振1郑召鹏1江飞龙2韩静3李雪涛3陈光朋3李杭1陈正堂3

目的探讨激光共聚焦检测miR-155 MB对肺癌活细胞中miR-155的识别成像功能。 方法设计锁核酸修饰的miR-155分子信标(MB)，同时设计不和任何序列结合的随机序列分子信标(RS MB)作为阴性对照；采用液相分子杂交试验验证其灵敏性和特异性，并进一步在肺肿瘤组织水平上验证。以纳米壳聚糖(CS)作为载体转染miR-155 MB，检测miR-155 MB对肺癌细胞中miR-155识别成像功能；同时采用miR-155抑制剂antagomir抑制miR-155的表达后检测miR-155 MB对肺癌细胞中miR-155的识别成像功能。 结果液相分子杂交实验中miR-155+miR-155 MB组荧光强度为miR-155 MB组的58倍，RS+RS MB组荧光强度为RS MB组的43倍(P<0.05)。在肺鳞癌、腺癌组织中，激光共聚焦可检测到较强的荧光信号，阴性对照组未检测到明显荧光信号。纳米壳聚糖转染miR-155 MB后, 可在肺癌活细胞中检测到较强的荧光信号，antagomir抑制miR-155的表达后，发现荧光信号明显降低(P<0.05)。 结论利用分子信标技术可以实现通过识别肺癌活细胞中的miR-155并成像肺癌细胞，从而为发现肺癌细胞并用于肺癌诊断提供了新的理论基础。

肺肿瘤；分子信标；microRNA

肺癌目前仍是我国发病率和病死率最高的恶性肿瘤，不少患者确诊时属于晚期，失去了手术机会，生存期短，病死率高[1-2]。分子信标(molecular beacon, MB)是一种发卡结构的荧光标记的寡核苷酸序列，由于分子信标本身不会产生荧光，当存在靶标DNA、RNA和微小RNA(miRNA)时，分子信标就会与之杂交产生荧光，所以可以根据检测荧光信号及荧光强度实现对靶DNA、RNA和miRNA进行实时成像和定量分析[3]。miRNAs是一类非编码的含有约20～22个核苷酸小RNA分子，在肿瘤的发生、发展、凋亡、侵袭转移中发挥重要作用[4]。miR-155是miRNA中常见的一种小分子RNA，在肺癌细胞及组织中高表达，在肺癌的发生、发展及预后中发挥重要作用[5]。因此，本研究基于以上理论，利用分子信标技术设计并合成miR-155 MB，检测其对肺癌活细胞中miR-155的识别成像功能，旨在为发现肺癌细胞提供新的理论基础。

材料与方法

一、主要材料

1. 细胞株：A549肺腺癌细胞系、H446小细胞肺癌细胞系购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)，人肺腺癌SPC-A1细胞购自中国科学院上海生化研究所。

2. 试剂和仪器：锁核酸修饰的miR-155 MB、RS MB由上海生工合成。Opti-MEM®I转染培养基、Tris 碱(三羟甲基氨基甲烷) 购自美国life technology公司。氯化钾、氯化镁购自成都科龙化学试剂厂。PRMI-1640培养基购自美国Hyclone公司，壳聚糖纳米由四川广汉恒宇新材料有限公司惠赠。SP5激光共聚焦扫描显微镜(德国LEICA公司)，Varioskan Flash多功能酶标仪(美国赛默飞世尔科技有限公司 )

二、实验方法

1. 分子信标的设计与合成: 从网站http://www.mirbase.org上检索成熟的人miR-155(hsa-miR-155)序列，根据hsa-miR-155设计合成miR-155 MB。同时设计阴性对照RS(random sequence) MB，即合成不与任何基因组序列结合的随机序列分子信标。MiR-155 MB ：5′-Cy5-C+CAGCG-ACC+CCT+ATCA+CGAT+TAGCATTAA-CGCT+GG-BHQ3-3′；RS MB: 5′-Cy5-C+CAGCG-AC+GCCA+ATG+ACC+TTA+AGCA TTAA-CGCT+GG-BHQ3-3′。3′端连接淬灭基团BHQ3，5′端连接红色荧光基团Cy5；划线部分为茎状结构序列，其余为环状机构序列；+N表示锁核酸(LNA)碱基修饰。合成的分子信标用TE(pH=8.0)稀释为10 μmol/L的储存液并分装后避光-20 ℃冻存。

2. 液相分子杂交实验 : 配置100 ml的杂交缓冲液，其中含10 mmol/L KCl、10 mmol/L Tris缓冲液和5 mmol/L MgCl2。取6 μl浓度为10 μmol/L的miR-155 MB或RS MB加入到594 μl的杂交缓冲液中，分子信标终浓度为100 nmol/L，总体积为600 μl，分装到96孔黑板的5个孔内，每孔体积100 μl。同时加入100 μl浓度为1 000 nmol/L的miR-155 MB和RS MB的靶向序列，浓度增高的目的是为保证分子信标与靶分子能够充分的结合。以缓冲液为空白孔，以未加靶分子序列的分子信标作为对照组，同时设置加入相同浓度比例的miR-155 MB+RS组和RS MB+miR-155组，验证分子信标的特异性，37 ℃恒温水浴箱内孵育60 min，Varioskan Flash多功能酶标仪检测各组Cy5的荧光强度。

3. miR-155分子信标检测人肺癌组织中miR-155的表达: 参考文献[6]方法 ，收集新桥医院经术后病理证实的新鲜肺鳞癌和腺癌标本各3例，常规制备冰冻切片，冰丙酮固定10 min，每张切片滴加100 nmol/L的miR-155分子信标50 μl，37 ℃孵育60 min；PBS充分漂洗后DAPI染细胞核，抗荧光淬灭封片剂封片，激光共聚焦显微镜检测miR-155 MB对肺癌组织中miR-155的识别成像功能，以RS MB作为阴性对照。

4. 细胞培养 : PRMI-1640培养基中加入10%的标准胎牛血清、青霉素链霉素双抗，A549、SPC-A1、H446肺癌细胞系均置于5% CO2、37 ℃孵箱中培养。

5. 激光共聚焦检测CS转染miR-155 MB后及antagomir抑制后对肺癌细胞中miR-155的识别成像功能: 取生长状态良好的A549、SPC-A1、H446肺癌细胞种板于激光共聚焦专用培养皿内，其中一组按试剂说明书操作加入终浓度为10 nmol/L的miR-155抑制剂antagomir作用24 h。参考本课题组前期研究方法[7]，按照Wcs/WMB质量比为7︰1的比例自组装方法合成CS-mir-155 MB及CS-RS MB，miR-155 MB和RS MB的终浓度为200 nM，37 ℃细胞培养箱内孵育120 min后加入300 μl Hoechst 33342染细胞核，37 ℃ 20 min，激光共聚焦显微镜观察并拍照，每组设置三个样本。

6. 荧光强度分析: 激光共聚焦显微镜观察并拍照后，每个培养皿内加入1 ml细胞裂解液，使细胞充分裂解。取96孔黑板，每组加入100 μl细胞裂解液，设置6个复孔，Varioskan Flash多功能酶标仪检测各组Cy5的荧光强度。

三、统计学方法

结　　果

一、液相分子杂交实验

当只有miR-155 MB和RS MB单独存在时，荧光信号很弱。当加入相对应的miR-155 MB及RS MB的靶向序列时，可产生强烈的荧光信号。RS+RS MB组荧光强度约为RS MB组的43倍，miR-155+miR-155 MB组荧光强度约为miR-155 MB组的58倍，两组之间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。而当有未对应的分子信标序列存在时，miR-155 MB及RS MB仍能保持稳定的茎环结构，不受外界其他序列的干扰，与单独存在miR-155 MB及RS MB组相比，无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

二、激光共聚焦检测miR-155 MB对人肺癌组织中miR-155的识别成像功能

当加入miR-155 MB分子信标孵育冰冻肺癌组织后，鳞癌和腺癌组织中均可检测到强度不同的红色荧光信号，大部分表达部位在肿瘤的细胞浆，小部分在细胞核；而在阴性对照RS MB组中未检测明显荧光信号，极少部分颗粒样荧光考虑杂质或非特异性染色，见图1。

图1miR-155 MB检测对肺癌组织miR-155的识别成像功能(×400)

三、激光共聚焦检测CS转染miR-155 MB后及antagomir抑制后对肺癌细胞中miR-155的识别成像功能

在有miR-155 MB存在的条件下，各组细胞均可看到较强的红色荧光信号，大部分定位在细胞浆，少数定位在细胞核。当加入miR-155的antagomir抑制剂后，由于miR-155的表达被抑制，激光共聚焦检测发现荧光信号明显降低，见图2。

表1　杂交缓冲液中各组荧光强度 (mean±SD，n=5)

图2CS转染miR-155 MB及antagomir抑制后检测对miR-155的识别成像功能(×800)

四、荧光强度分析

酶标仪检测Cy5荧光强度发现，在miR-155 MB组，H446细胞中荧光强度最高，A549细胞荧光信号最弱。在加入miR-155的antagomir抑制剂后，荧光强度显著降低，和未加antagomir抑制剂组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图3。表明本实验所设计的miR-155分子信标能够动态的监测miR-155的表达变化，具有较高的灵敏性和特异性。

图3酶标仪检测A549、SPC-A1、H446细胞中各组荧光强度(×800)；注：P<0.05

讨　　论

分子信标是一种分子内互补形成发卡结构的荧光标记的寡核苷酸序列，主要由4个部分组成：环、茎、荧光基团、淬灭基团。自然状态下，分子信标为茎环结构，从而使得荧光基团和淬灭基团彼此靠近，荧光基团和淬灭基团可以发生荧光共振能量转移，荧光基团发出的荧光分子被淬灭基团淬灭、吸收,从而无法产生荧光。当分子信标内的寡核苷酸与靶基因如DNA、RNA、miRNA序列结合后，分子信标的茎环结构打开，荧光基团与淬灭基团彼此分离，荧光基团发出的荧光不会被淬灭基团淬灭，从而发出荧光[8]。由于分子信标本身不会产生荧光，当存在目标DNA、RNA和miRNA时，分子信标才会与之杂交产生荧光，所以可以根据荧光强度及检测荧光信号实现对靶DNA、RNA和miRNA进行实时成像和定量分析。分子信标技术非常灵敏，当和靶序列只有1个碱基的差别时，分子信标仍然保持茎环结构，不会产生荧光，可以检测出一个碱基的差别，表明分子信标具有较高的特异性和灵敏性，为检测细胞内基因突变及检测细胞内基因表达变化提供了可能[9-10]。

分子信标设计原则是，环状区一般由15～30个核苷酸组成，避免同源杂交，茎干区一般由5～8个碱基对组成，GC含量在70%至80%之间，5′端连接荧光染料，3′端连接淬灭剂；连接荧光基团的末端最好不用G，荧光基团需要能被淬灭基团特异性淬灭[11]。锁核酸修饰的碱基可以提高分子信标的杂交能力及抗核酸酶能力，增加分子信标的稳定性[12]。因此本研究基于以上特点设计了经过锁核酸修饰的miR-155分子信标，同时以RS MB作为阴性对照。当miR-155 MB和RS MB单独存在时，分子信标保持茎环结构。当与靶目标miR-155 及RS序列相遇后，茎环结构打开，可产生强烈的荧光信号。而当加入其它未对应的序列时，miR-155 MB和RS MB保持稳定结构，荧光信号很弱。表明设计的miR-155 MB和RS MB具有高度的稳定性、灵敏性、特异性。由于大量研究表明肺癌组织较正常组织高表达miR-155，我们选取了临床肺鳞癌和腺癌组织标本各3例，当加入miR-155 MB分子信标孵育冰冻肺癌组织后，鳞癌和腺癌组织中均可检测到强度不同的红色荧光信号，表明在有miR-155存在时，miR-155分子信标可以与组织中的miR-155结合，从而导致荧光的产出。阴性对照组未检测到荧光信号，表明我们设计的阴性对照RS MB不和其他基因组序列结合，具有较高的特异性，适合作为阴性对照。

由于分子信标本身是寡核苷酸，所以需要理想的转运载体携带进入活细胞，理想的载体既可以保护分子信标被免于降解，又要在细胞内发挥靶向识别核酸序列的功能，以便对活细胞进行可视化研究。随着纳米科技迅猛发展，纳米材料在医学领域中的应用越来越广泛[13]。纳米壳聚糖可从自然界中大量获取，毒性及免疫原性低，可以和RNA、DNA自组装成稳定的核壳结构，保护RNA、DNA不被血清酶降解，保证基因运送的效率和准确表达[14]，是分子信标理想的载体[7]。本研究发现在纳米壳聚糖转染miR-155 MB后，在miR-155 MB存在的条件下，由于肺癌细胞中均有miR-155的表达，各组细胞均可看到较强的红色荧光信号。当加入miR-155的antagomir抑制剂后，由于miR-155的表达被抑制，激光共聚焦检测发现荧光信号明显降低，表明我们所设计的miR-155分子信标能够动态的监测肺癌细胞内miR-155的表达变化，具有较高的灵敏性和特异性。以上研究表明本研究利用分子信标技术实现了通过识别肺癌活细胞中的miR-155并成像肺癌细胞，从而为发现肺癌细胞并用于肺癌诊断提供了新的理论基础。

1Chen W, Zheng R, Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016, 66(2): 115-132.

2江飞龙, 韩静, 朱海振, 等. 人肺腺癌厄洛替尼耐药细胞PC9/ER的建立及奥曲肽改善耐药机制研究[J/CD]. 中华肺部疾病杂志: 电子版, 2015, 8(2): 149-153.

3Lee J, Moon SU, Lee YS, et al. Quantum dot-based molecular beacon to monitor intracellular microRNAs[J]. Sensors (Basel), 2015, 15(6): 12872-12883.

4Li J, Tan S, Kooger R, et al. MicroRNAs as novel biological targets for detection and regulations[J]. Chem. Soc. Rev, 2014, 43(2): 506-517.

5Xie K, Ma H, Liang C, et al. A functional variant in miR-155 regulation region contributes to lung cancer risk and survival[J]. Oncotarget, 2015, 6(40): 42781-42792.

6Peng XH, Cao ZH, Xia JT, et al. Real-time detection of gene expression

in cancer cells using molecular beacon imaging: new strategies for cancer research[J]. Cancer Res, 2005, 65(5): 1909-1917.

7Zhu HZ, An JH, Yao Q, et al. Chitosan combined with molecular beacon for mir-155 detection and imaging in lung cancer[J]. Molecules, 2014, 19(9): 14710-14722.

8Chen J, Wu J, Hong Y. The morpholino molecular beacon for specific

RNA visualization in vivo[J]. Chem Commun (Camb), 2016, 52(15): 3191-3194.

9Dong H, Ma J, Wang J, et al. A Biofunctional Molecular Beacon for Detecting Single Base Mutations in Cancer Cells[J]. Mol Ther Nucleic Acids, 2016, 5: e302.

10Giannetti A, Barucci A, Cosi F, et al. Optical fiber nanotips coated with molecular beacons for DNA detection[J]. Sensors (Basel), 2015, 15(5): 9666-9680.

11Li Y, Zhang J, Zhao J, et al. A simple molecular beacon with duplex-specific nuclease amplification for detection of microRNA[J]. Analyst, 2016, 141(3): 1071-1076.

12Morinaga S, Nakamura Y, Atsumi Y, et al. Locked nucleic acid in situ hybridization analysis of microRNA-21 predicts clinical outcome in patients after resection for pancreatic cancer treated with adjuvant gemcitabine monotherapy[J]. Anticancer Res, 2016, 36(3): 1083-1088.

13陈华萍, 王关嵩. 纳米材料与疾病的诊断和治疗[J/CD]. 中华肺部疾病杂志: 电子版, 2015, 8(3): 374-376.

14Azuma K, Izumi R, Osaki T, et al. Chitin, chitosan, and its derivatives

for wound healing: old and new materialsr[J]. J Funct Biomater, 2015, 6(1): 104-142.

(本文编辑：王亚南)

朱海振，郑召鹏，江飞龙，等. 基于分子信标技术对活细胞内miR-155检测用于肺癌诊断[J/CD]. 中华肺部疾病杂志： 电子版， 2016， 9(4)： 361-365.

Detecting the miR-155 in living cells for lung cancer diagnoses based on molecular beacon technology

ZhuHaizhen1,ZhengZhaopeng1,JiangFeilong2,HanJing3,LiXuetao3,ChenGuangpeng3,LiHang1,ChenZhengtang2.

1DepartmentofOncology,GuizhouProvincialPeople'sHospital,Guiyang550002,China;2DepartmentofOncology,ChineseMedicineHospitalOfChongqing,Chongqing400037,China;3InstituteofCancer,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China

LiHang,Email:lihang.sy@163.com,ChenZhengtang,Email:czt05@163.com

ObjectiveDesigned the miR-155 molecular beacon (MB) which was modified by lock nucleic acid based on MB technology, detected and imaged the miR-155 in lung cancer cells by the laser confocal microscopy. MethodsDesigned the miR-155 MB which was modified by lock nucleic acid and the random sequence molecular beacon (RS MB) which was not complementary with any other sequences as the negative control. The specificity and sensitivity of the designed molecular beacon was detected by the hybridization assay and was verified in the lung cancer tissues. Chitosan(CS) nanoparticles were adopted to deliver the miR-155 MB. The laser confocal microscopy was used to detect and image the miR-155 or the miR-155 inhibited by the antagomir in lung cancer cells at the same time. ResultsHybridization assay showed that the fluorescence intensity in the miR-155+miR-155 MB group was 58 times higher than that in the only miR-155 MB group, and the fluorescence intensity in the RS+RS MB group was 431 times higher than that in the only RS MB group (P<0.05). The fluorescence signal could be detected in the lung cancer tissues and could not be detected in the RS MB group. The fluorescence signal could be detected in the lung cancer cells after CS transfect the miR-155 MB. The fluorescence signal was significantly decreased after the miR-155 expression was inhibited by the antagomir(P<0.05). ConclusionThe miR-155 MB could detect the miR-155 in the lung cancer cells and imaging them based on molecular beacon technology and provided new theoretical basis for diagnosis of lung cancer.

Lung neoplasms;Molecular beacon;microRNA

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.04.002

国家高技术发展研究计划“863”项目(2008AA02Zl29)

国家自然科学基金面上资助项目(81071786)

550002 贵阳，贵州省人民医院肿瘤科1

400015 重庆市中医院肿瘤科2

李杭, Email：lihang.sy@163.com

陈正堂, Email：czt05@163.com

R734

A

2016-04-22)

400037 重庆，第三军医大学新桥医院全军肿瘤研究所3