张坤木, 李长辉,宋红梅,陈　彦，陈倩婧,钟灼琴

(1. 福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州 350003；2. 福建省立医院，福建 福州 350003)



论著

分子生物学技术研究桂枝加葛根汤和独活寄生汤防治颈/腰椎病的机制

张坤木1, 李长辉1,宋红梅1,陈彦1，陈倩婧1,钟灼琴2

(1. 福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州 350003；2. 福建省立医院，福建 福州 350003)

目的运用分子生物学技术研究桂枝加葛根汤和独活寄生汤防治颈/腰椎病的起效机制。方法用低、中、高剂量桂枝加葛根汤血清和独活寄生汤血清及空白血清分别干预大鼠颈/腰椎间盘细胞，再采用MTT比色法和Western blotting技术分别检测各组大鼠颈/腰椎间盘细胞生长情况和CaM、CaMK、CREB相关蛋白表达水平。结果干预后第1天，5组间颈/腰椎间盘细胞生长情况比色值比较差异无统计学意义(P均>0.05)；干预后的第2—7天，各中药血清组和胎牛血清组颈/腰椎间盘细胞生长情况比色值均明显高于空白血清组(P均<0.05)，且随作用时间呈递增趋势。各中药血清组和胎牛血清组颈/腰椎间盘细胞CaM、CaMK和CREB蛋白表达量均明显高于空白血清组(P均<0.05)；中、高剂量中药血清组和胎牛血清组各蛋白表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，但此3组各蛋白表达量均高于低剂量中药血清组(P均<0.05)，且高剂量中药血清组各蛋白表达量均明显高于中剂量中药血清组(P均<0.05)。结论分子生物学技术研究提示桂枝加葛根汤和独活寄生汤可能通过促进颈/腰椎椎间盘细胞的生长及相关蛋白的表达水平达到防治颈/腰椎病的目的，而且其效应过程可能存在一条重要的信号通路即CaM-CaMK-CREB通路。

桂枝加葛根汤；独活寄生汤；颈椎病；腰椎病；信号通路

近年来，随着城市生活节奏的加快、电子产品的普及，办公人员几乎都需要在电脑前长时间伏案、久坐工作，即便是工作之余，大部分人仍然离不开手机，使得颈腰椎病成为目前临床常见病、多发病[1-2]。研究发现，我国目前颈椎病的发病率为17.3%，人一生中患颈椎病的概率为60%～90%，是导致45岁以下成人丧失劳动能力的最常见原因之一[3]。据统计，60%～80%的美国成年人在生活中有过腰痛的病因，由此也造成了巨大的医疗负担，每年用于腰痛的花费是各类肿瘤总花费的3倍以上[4]。因此，寻求“简便验廉”的方法更好地防治颈腰椎疾病具有重要的社会经济效益，成为目前国内外重点研究的课题。临床治疗方面中药方剂具有“简便验廉”的优点，诸多临床研究表明桂枝加葛根汤对颈椎病、独活寄生汤对腰椎病具有明显的治疗效果[5-10], 但以上研究大都局限于临床病例观察，其具体的起效机制尚未见深入报道研究。故笔者进行了相关的机制研究，现将结果报道如下。

1　实验资料

1.1药物、试剂与仪器

1.1.1中药药物桂枝加葛根汤由葛根、芍药、生姜、甘草、大枣、桂枝组成；独活寄生汤由独活、桑寄生、杜仲、牛膝、细辛、秦艽、茯苓、肉桂心、防风、川芎、人参、甘草、当归、芍药、干地黄组成。

1.1.2主要试剂胎牛血清(杭州四季青生物公司)；DMEM培养基、Ⅱ型胶原酶(美国Gibco公司)；胰蛋白酶、EDTA(美国Amresco公司)；RIPA裂解液(强)(北京碧云天公司)；甲苯胺蓝染料(上海江莱生物科技有限公司，CAS:6586-4-5)；BCA蛋白定量试剂盒(北京碧云天公司)；DMSO(美国Sigma公司)；PMSF(北京碧云天公司)；Tris、甘氨酸(美国NOVON公司)；丙烯酰胺(上海博亚公司)；预染蛋白Marker(美国Invitrogen公司,SeeBlue Jia2)；Tween20(美国Amresco公司)；兔抗CaMⅠ、CaMKⅡ、CaMKⅣ及CREB单克隆抗体(美国Cell Signaling公司)；辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金桥公司ZB-2301)；辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(北京中杉金桥公司ZB-2305)；Mouse Anti-beta Actin Monoclonal antibody(北京中杉金桥公司TA-09)；ECL化学发光试剂盒(美国Cell Signaling公司)；显影定影液(美国Kodak公司)；NC膜(美国Biosciense公司)；细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒(北京碧云天公司)；其余试剂购买已经配好的成品。

1.1.3主要仪器设备生物净化工作台(苏州净化设备有限公司SW-CJ-IF)，倒置显微镜(德国Leica公司)，CO2培养箱(日本SANYO公司)，电热式压力消毒器(上海PHS-25)，离心沉淀器(上海手术器械厂80-2 CENTRIFUGE) ，恒温水浴锅(深圳HH-4)，550型酶标仪(美国BIO-RAD公司)，稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂DYY-6B)，电泳系统(美国BIO-RAD 公司)，凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司Gel Doc XR)。

1.2动物①健康清洁级SD大鼠160只，雌雄各半，体质量(200±10)g，用于制备中药血清及空白血清；②健康1个月龄清洁级SD大鼠2只，雌雄不拘，体质量100 g左右，用于提取颈/腰椎间盘细胞。以上动物均来源于上海斯莱克实验动物有限责任公司[许可证号SCXX(沪)]，饲养于福建中医药大学实验动物中心(医动字23-016号)。

1.3方法实验分为颈椎和腰椎2部分，颈椎实验所用中药为桂枝加葛根汤，腰椎实验所用中药为独活寄生汤，2部分实验方法相同。

1.3.1中药药物制备由福建中医药大学附属第二人民医院药物制剂中心严格按《伤寒论》《备急千金要方》原方剂量比例制备。

1.3.2中药血清及空白血清的制备[11-13]将制备好的中药药物按体表面积折算成动物的等效剂量，大鼠生药量为11.6 g/kg。每项实验各取SD大鼠80只以计算机随机分组法分为低剂量组、中剂量组、高剂量组和空白组各20只。低剂量组以等效剂量的0.5倍(每只1 mL)、中剂量组以等效剂量(每只2 mL)、高剂量组以2倍剂量(每只4 mL)灌胃,空白组以2 mL生理盐水代之。均连续灌胃4 d，每天2次，于末次灌胃2 h后乙醚吸入麻醉，于腹主动脉及心脏采血，分离血清,-20 ℃保存，备用。

1.3.3大鼠颈/腰椎间盘细胞原代培养、传代培养及鉴定参考文献[14-18]，反复实验研究出简单易行、重复性强的方法，具体方法见文献[19-20]。

1.3.3.1大鼠颈/腰椎间盘纤维环细胞原代培养大鼠麻醉后脱颈处死， 75%乙醇浸泡5 min，置于第一超净台内，于托盘内沿后正中线剪开皮肤，用75%的乙醇擦拭；更换手套和手术器械后沿棘突用剪刀剪开两旁肌肉，沿椎弓根剪断肋骨，将整条脊柱取出，尽量剥离椎间盘前缘所附着的肌肉，用磷酸盐缓冲液PBS(含青链霉素)冲洗3遍以上至无明显血迹。用眼科剪分离出椎间盘，放入盛有PBS无菌培养皿中漂洗3遍，用尖刀将髓核去除干净，再用眼科剪将纤维环剪成1 mm3的小块，再用磷酸盐缓冲液PBS漂洗2遍，800 r/min×2 min离心，收集沉淀，用2.5 g/L胰蛋白酶37 ℃消化15 min，DMEM终止消化。1 000 r/min×5 min离心，去上清，沉淀用无血清培养液清洗2次后加入1 g/L Ⅱ型胶原酶，37 ℃消化。待组织大部分消化(约需4 h)，用DMEM培养液终止消化，200目不锈钢网过滤，收集悬液，1 000 r/min×5 min离心得细胞团，弃上清液，加入DMEM(内含15%的胎牛血清)液稀释，以细胞2×104/cm2接种到100 mL塑料培养瓶中，置于37 ℃、5%的CO2培养箱中培养；如果有剩余组织，可以往组织块中加入1 g/L Ⅱ型胶原酶过夜消化，步骤同上。逐日倒置显微镜观察，每隔3 d换液1次。

1.3.3.2大鼠颈/腰椎间盘纤维环细胞传代培养当细胞生长至近培养瓶底面积的90%时(原代细胞培养12～16 d)进行传代，弃培养液，用0.01 mol/L PBS洗涤细胞2次，弃掉液体，沿瓶壁均匀滴入0.25%的胰蛋白酶(含0.01%的EDTA)，轻晃动培养瓶，镜下观察消化情况，见细胞皱缩、间隙加大、个别细胞变圆漂浮时立即用含血清的培养液3 mL终止消化，再用滴管轻轻吹打细胞数次制成细胞悬液，1 000 r/min×5 min离心弃上清液，加入DMEM培养液(内含15%的胎牛血清)混悬细胞后按1∶2接种。细胞传代培养1代后可换成10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养。

1.3.3.3纤维环细胞甲苯胺蓝染色将第3代传代纤维环细胞接种在放有预处理盖玻片的6孔培养板中进行细胞爬片，待细胞长成单层时进行甲苯胺蓝染色。中性树胶封固，显微镜下观察，拍照记录。

1.3.3.4纤维环细胞Ⅰ，Ⅱ型胶原的免疫细胞化学染色将第3代传代纤维环细胞，以2×104/cm2接种在放有预处理盖玻片的6孔培养板中进行细胞爬片，待细胞长成单层时，进行Ⅰ，Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色，中性树胶封固，显微镜下观察，拍照记录。

1.3.4MTT比色法测定大鼠颈/腰椎间盘细胞生长曲线参考张慧锋等[21]关于细胞活性检测方法优化研究中的方法，结合本实验实际情况主要分为4个步骤：①计算细胞量，调整浓度。预设5组，5个复孔，每孔4 000个细胞，每孔加入100 μL。将二代培养细胞消化下来后计算培养基中的细胞总数，根据已知每孔浓度400个/100 μL =4×104个/mL,计算出所需往培养瓶中加入的DMEM培养液，使得最终浓度为4×104个/mL，再取出其中5×5×100 μL×7=17.5 mL，分别加入96孔板中。②培养细胞。先用上述含10%胎牛血清的DMEM培养液孵育24 h，使细胞贴壁再弃除培养液，5孔分别加入空白血清、低剂量中药血清、中剂量中药血清、高剂量中药血清和胎牛血清各10 μL，每2 d换液1次。③呈色。之后的每天取出其中一板，先直接往每孔加入MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，弃所有液体，加入150 μL DMSO，振荡10 min。④比色。置于492 nm波长的酶标仪上检测吸光度值(即比色值)。

1.3.5Western blotting检测相关蛋白表达水平

1.3.5.1实验步骤参考李莎莎等[22]关于Western blotting检测方法。取蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳90 min，按照湿转法将电泳产物放在NC膜上转膜2 h，TBST液清洗3次，将NC膜放入封闭液中室温下摇床2 h，置于4 ℃冰箱过夜，一抗孵育用TBS稀释(1∶500)室温下孵育2 h，TBST清洗3次，每次10 min；二抗孵育用TBST稀释(1∶3 000)室温下孵育2 h,TBS清洗2次，每次5 min。最后用购买的AB试剂盒显色，胶片成像收集图像。

1.3.5.2蛋白条带分析采用BIO-RAD 凝胶成像系统采集胶片图像，运用Image-Pro Jia 6.0软件计算条带的OD值，并进行半定量分析。

2　结　　果

2.1各组大鼠颈/腰椎间盘细胞生长情况比色值比较干预后第1天，5组间颈/腰椎间盘细胞生长情况比色值比较差异无统计学意义(P均>0.05)；干预后的第2—7天，各中药血清组和胎牛血清组颈/腰椎间盘细胞生长情况比色值均明显高于空白血清组(P均<0.05)，且随作用时间呈递增趋势。见表1。

表1　各组大鼠颈/腰椎间盘细胞生长情况比色值比较±s)

注：①与空白血清组比较，P<0.05。

2.2各组大鼠颈/腰椎间盘细胞CaM、CaMK和CREB蛋白表达情况比较各中药血清组和胎牛血清组颈/腰椎间盘细胞CaM、CaMK和CREB蛋白表达量均明显高于空白血清组(P均<0.05)；中、高剂量中药血清组和胎牛血清组各蛋白表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，但此3组各蛋白表达量均高于低剂量中药血清组(P均<0.05)，且高剂量中药血清组各蛋白表达量均明显高于中剂量中药血清组(P均<0.05)。见表2。

表2　各组大鼠颈/腰椎间盘细胞CaM、CaMK和CREB蛋白表达情况比较

注：①与空白血清组比较，P<0.05；②与低剂量中药血清组比较，P<0.05；③与中剂量中药血清组比较，P<0.05。

3　讨　　论

桂枝加葛根汤原方出自张仲景《伤寒论》，主治太阳中风兼太阳经气不舒证。颈椎病主症为颈项僵硬、颈肩疼痛，颈项背部又为太阳经脉循行部位，颈背拘急转动不能自如，多为风寒外束、经气不舒、津液阻滞不能敷布,以致经脉失于濡养。方中桂枝为君，助卫阳，通经络，解肌发表而祛在表之风邪。白芍益阴敛营，固敛外泄之营阴，桂芍等量合用，内调营卫、阴阳，外可解肌发表；葛根解肌祛风而帮助桂枝汤发表解肌、宣通经气，解经脉气血之郁滞，生津液以缓经脉之拘急，共为臣药。生姜辛温，既助桂枝辛散表邪，又兼和胃止呕；大枣甘平，既能益气补中，又可资脾生津。姜枣相配，是为补脾和胃、调和营卫的常用组合，共为佐药。炙甘草调和药性，合桂枝辛甘化阳以实卫，合芍药酸甘化阴以和营，功兼佐使之用。上药共奏解肌祛风、调和营卫、升津舒经之功。

独活寄生汤方原出孙思邈《备急千金要方》。方中重用独活为君，辛苦微温，善治伏风，除久痹，且性善下行，以祛下焦与筋骨间的风寒湿邪。臣以细辛、防风、秦艽、桂心、细辛入少阴肾经，秦艽祛风湿、舒筋络而利关节，桂心温经散寒，通利血脉，防风祛一身之风而胜湿；佐入桑寄生、杜仲、牛膝以补益肝肾而强筋健骨，当归、川芎、地黄、白芍养血和血，人参、茯苓、甘草健脾益气。纵观全方，以祛风寒湿邪为主，辅以补肝肾、益气血之品，邪正兼顾，祛邪不伤正，扶正不留邪。

血清药理学是指将中药或中药复方经口给动物灌服一定时间后采集动物血液,分离血清，用含有药物成分的血清进行体外实验的一种半体内实验方法。该方法对中药离体实验有重大意义，主要针对中药及其复方复杂多样的化学成分特点，用含药血清代替煎剂或粗提物进行体外实验，克服了中药粗制剂直接进行体外实验的缺点,其结果的可信度高。

本实验通过MTT比色法检测中药血清对大鼠椎间盘细胞生长的影响，结果发现低、中、高剂量中药血清和胎牛血清均能明显促进大鼠椎间盘细胞生长，这种作用跟时间、剂量息息相关，随着中药剂量的增加，中药血清促进细胞生长能力增强。但同时由于MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数，说服力度不够，如何更精确地测定其真实细胞数有待进一步深入探讨。本实验Western blotting方法检测结果发现，各剂量中药血清均能提高大鼠椎间盘细胞CaM、CaMK Ⅱ、CaMK Ⅳ和CREB蛋白表达量，但在等效剂量(相当于本实验的中剂量)以下中药血清在提高相关蛋白表达能力方面与胎牛血清比较差异有统计学意义，等效剂量以上的中药血清在提高相关蛋白表达水平方面与胎牛血清组比较差异无统计学意义。

综上所述，分子生物学技术研究提示桂枝加葛根汤和独活寄生汤可能通过促进颈/腰椎椎间盘细胞的生长及相关蛋白的表达水平达到防治颈/腰椎病的目的，而且其效应过程可能存在一条重要的信号通路即CaM-CaMK-CREB通路，为临床传统中药方剂防治颈腰椎病提供了理论支持。但由于实验条件的限制，本课题设计中并未加入相关蛋白抑制剂，Western blotting检测结果只能说明应用中药血清作用于大鼠椎间盘细胞可明显改变CaM、CaMK、CREB表达，但临床上防治颈/腰椎病的效应过程是否确实存在着一条重要的信号通路即CaM-CaMK-CREB尚有待进一步研究，而且是否存在其他信号通路影响也将是需要进一步深入探讨的重要问题。

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Study on the mechanism of prevention and treatment for cervical or lumbar disease with Guizhi+Gegen decoction and Duhuo Jisheng decoction by molecular biology

ZHANG Kunmu1, LI Changhui1,SONG Hongmei1,CHEN Yan1,CHEN Qianjing1,ZHONG Zhuoqin2

(1.The Second People’s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350003,Fujian,China；2.Fujian Provincial Hospital,Fuzhou 350003,Fujian,China)

Objective It is to study the mechanism of prevention and treatment for cervical or lumbar disease with Guizhi+Gegen decoction and Duhuo Jisheng decoction by molecular biology. Methods Lumbar/cervical cells in rats were treated respectively with low, medium, high dosage of serum which contained Guizhi+Gegen decoction,Duhuo Jisheng decoction and blank serum. Then the growth of the cells and the expression of correlated protein of CaM, CaMK, CREB in every group were detected by MTT colorimetric method and Western blotting technology. Results On the first day of intervention, there was no significant difference in the colorimetric value of growth of lumbar/cervical cells among the five groups(P>0.05); On the second day to the seventh day, the values in every Chinese medicine group and fetal calf serum group were significantly higher than that in blank serum group (P<0.05), and the effects were more significant with the time increase. The expression of correlated protein of CaM, CaMK, CREB in every Chinese medicine group and fetal calf serum group was obviously higher than that in blank serum group (P<0.05), there was no significant difference in the expression among medium, high dosage of Chinese medicine serum group and fetal calf serum group(P>0.05), but the expression was higher than that in low dosage group (P<0.05), and the expression in high dosage group was higher than that in medium dosage group (P<0.05). Conclusion By molecular biology technology research showed that Guizhi+Gegen decoction and Duhuo Jisheng decoction can promote the growth of the cervical, lumbar intervertebral disc cells and related protein expression level to achieve the purpose of prevention and treatment of neck, lumbar disease, and its effect to process there may be an important signaling pathways, that is CaM- CaMK-CREB pathway.

Guizhi+Gegen decoction; Duhuo Jisheng decoction; cervical spondylosis；lumbar disease; signaling pathways

张坤木，男，主治医师，硕士，从事脊柱病及其相关性疾病的基础与临床研究。

钟灼琴，E-mail:277873495@qq.com

福建省卫生厅青年课题(2013-1-39)；福建省卫生厅中医药课题(wzkf201304；wzln201302)；福建省自然科学基金资助项目(2013J01320)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.25.001

R-332

A

1008-8849(2016)25-2737-05

2016-04-20