李斌，费希同，唐军荣，尹丽莎，韩国伟，辛培尧

(西南林业大学国家林业局西南地区生物多样性保育重点实验室，云南省高校林木遗传改良与繁育重点实验室，云南 昆明　650224)



‘黄花倒水莲’离体快繁技术研究

李斌，费希同，唐军荣，尹丽莎，韩国伟，辛培尧

(西南林业大学国家林业局西南地区生物多样性保育重点实验室，云南省高校林木遗传改良与繁育重点实验室，云南 昆明650224)

【目的】 研究并建立‘黄花倒水莲’离体快繁技术体系.【方法】 以‘黄花倒水莲’嫩茎为外植体，经不同方法消毒后，接种于MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L的培养基中诱导不定芽发生，继而将不定芽接种在附加不同种类及浓度外源激素的培养基进行培养，根据增殖和生根情况，筛选适宜的‘黄花倒水莲’增殖及生根培养基；然后将生根试管苗移栽于不同的基质中，依据成活率，确定其最佳炼苗基质.【结果】 用75%酒精消毒10 s，0.1%升汞消毒15 min获得了较好的消毒效果，污染率低至3.15%；适宜‘黄花倒水莲’增殖的培养基为MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L，增殖系数为5.50；在1/2 MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.3 mg/L+0.2 g/L 活性炭的生根培养基中，其生根率可达96%；‘黄花倒水莲’试管苗炼苗的最佳基质为红壤∶腐殖土∶珍珠岩=1∶1∶1，成活率为94.5%.【结论】 成功建立了‘黄花倒水莲’离体快繁技术体系.

‘黄花倒水莲’；离体快繁；技术

‘黄花倒水莲’(PolygalafallaxHemsl)别名黄花参、黄花吊水莲、观音串、黄花大远志等，属远志科(Polygalaceae)远志属(Polygala) 植物[1]，主要分布于我国的福建、湖南、广西等地[2-4].‘黄花倒水莲’是一种较为珍稀的中药材，全草入药，性味甘、微苦，有补益气血，健脾利湿，活血调经之功效，是瑶、苗、壮等少数民族常用的民间药物[5].‘黄花倒水莲’作为一种珍贵的药材，随着药材市场对其需求的不断增加，一再出现供不应求的局面，一些地区甚至出现紧缺的状况.由于其野生资源不断被挖掘利用，已难以满足目前的市场需求.‘黄花倒水莲’以种子繁殖较多，但繁殖能力弱[6].因此要开发及利用好‘黄花倒水莲’这一重要资源，就必须解决其快繁问题，而组织培养技术是在短期内迅速扩大种苗数量的最有效方法.有关‘黄花倒水莲’的离体快繁研究，仅见国内有相关报道[7-9]，但在稳定性及可重复性方面有一定的局限性.因此，建立稳定性好，重复性高的‘黄花倒水莲’离体快繁技术，有望实现‘黄花倒水莲’优良种质的快速繁殖，对解决其野生资源匮乏而供不应求的现状具有重要意义.

1　材料与方法

1.1试验材料

试验材料为‘黄花倒水莲’当年生带有嫩茎的枝条，来自福建三明市清流县.

1.2试验方法

1.2.1材料预处理外植体在洗洁精水中漂洗3～5 min，然后用流水冲洗30 min.在清洗过程中对过长或过大的枝条进行修剪，方便后续的消毒工作.

1.2.2外植体消毒及不定芽诱导取上述预处理的材料，用75%酒精和0.1%的升汞进行消毒，设置不同的消毒时间以确定适宜黄花倒水莲的消毒方案(表1).材料经消毒后切成长约2 cm带1-2个叶腋的茎段，竖直插于培养基MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L中，附加30.0 g/L蔗糖，5.0 g/L琼脂，pH 5.7(下同).试验共计12个处理，每个处理20瓶，每处理放置外植体4段.茎段叶腋处诱导出的不定芽，则用作增殖培养的材料.

表1　‘黄花倒水莲’外植体消毒方案Tab.1　The disinfection scheme of P.fallax explants

1.2.3增殖培养截取1.2.2中诱导出的不定芽，约1 cm长，分别以MS和WPM为基础培养基，采用相同激素种类及浓度配比设计方案，进行黄花倒水莲增殖培养基的筛选.试验设计如表2.试验共计18个处理及1个对照，每个处理20瓶，每处理放置材料4段.

表2　‘黄花倒水莲’增殖培养基方案Tab.2　The culture medium scheme ofP.fallax proliferation　(mg·L-1)

1.2.4生根培养试验设计IBA、NAA 2种激素不同浓度与不同量的活性炭配比，添加到1/2 MS培养基中(表3).选取经增殖培养的健壮试管苗，切取顶芽长约2 cm接入培养基中.试验共计9个处理及1个对照，每个处理20瓶，每处理放置材料4段.

1.2.5炼苗移栽以红壤、腐殖土和珍珠岩为原料，配置6种不同的基质，其配比设计如表4.将生根良好，生长健壮的试管苗从组织培养室移至普通实验室或温室大棚，瓶内炼苗5d，然后将瓶盖揭开1/3的开度，炼苗2 d，最后将瓶盖完全揭开，炼苗1 d后，将组培苗从组培瓶中移栽至基质中，并用小拱棚覆盖.炼苗过程中，要保证基质足够的水分，并采取一定的遮光措施.

表3　黄花倒水莲生根培养基方案Tab.3　The culture medium scheme of P.fallax rooting

表4　黄花倒水莲移栽基质方案Tab.4　The matrix scheme of P.fallax transplanting

1.2.6培养条件上述室内培养，均是在温度25 ℃，光照强度1 200 lx，光照周期12 h/d的条件下进行的.

1.3数据处理

试验数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析.

2　结果与分析

2.1外植体消毒结果

‘黄花倒水莲’经不同消毒处理后，结果见表5.在12种处理中，污染率最高的是处理1，污染率为45.71%，污染率最低的是处理8，污染率为2.47%.消毒时间处理7-10之间无显著差异，污染率均较低(分别为3.15%、2.47%、2.66%及3.52%).说明在这4种消毒条件下，均可获得良好的消毒效果.但处理7中，外植体生长情况较处理8-10均要好.因此认为，处理7(75%酒精10 s，0.1%升汞15 min)为‘黄花倒水莲’外植体消毒的最理想方法.初代培养15 d左右，叶腋处可诱导出不定芽，在30 d后即可长至2～3 cm高(图1).

表5　不同消毒处理效果比较Tab.5　The effect compare of different disinfection treatment

表中同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05).

图1　‘黄花倒水莲’腋芽诱导Fig.1　Axillary buds induce of P.fallax

2.2增殖培养结果

在不同的增殖培养基中，‘黄花倒水莲’不定芽的增殖效果如表6，未添加激素的对照中增殖系数最低，分别为2.08和1.89，说明外源激素的加入可以明显提高‘黄花倒水莲’的增殖系数.在添加了外源激素的处理中，以MS为基础培养基中处理4的增殖系数最高为5.50，且与其他各处理均有显著差异.处理11的增殖系数最低为2.29；以WPM为基础培养基中处理6的增殖系数最高为4.13，且与其他各处理均有显著差异.处理10的增殖系数最低为1.39.因此，‘黄花倒水莲’不定芽最佳增殖培养基为MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L(图2).

表6　不同培养基对‘黄花倒水莲’不定芽增殖的影响Tab.6　The influence on adventitious buds proliferation of P.fallax in different culture medium

表中同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05).

图2　‘黄花倒水莲’增殖培养Fig.2　P.fallax proliferation culture

2.3生根培养结果

不同的生根培养条件下‘黄花倒水莲’的生根效果不同(表7).生根率最低处理为未添加任何激素的对照组CK，为21.0%，其余1-9处理试验中的生根率均在50.0%以上，说明外源激素的加入有利于‘黄花倒水莲’生根.生根率最高为处理4，达96.0%，且生根条数和根长也在所有处理中最高.综合分析认为，处理4(1/2 MS+IBA 0.1 mg/L+ NAA 0.3 mg/L+0.2 g/L活性炭)为‘黄花倒水莲’的最佳生根培养基(图3).

表7　不同培养基对‘黄花倒水莲’生根的影响Tab.7　The influence on P.fallax rooting in different culture medium

表中同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05).

图3　‘黄花倒水莲’生根培养Fig.3　P.fallax rooting culture

2.4炼苗移栽结果

由表8可知，不同的移栽基质对‘黄花倒水莲’的生根率有显著差异，成活率最低的是处理1，成活率仅为66.7%，在处理6的基质中，‘黄花倒水莲’试管苗的成活率最高为95.2%，且与处理4和处理5之间差异不显著(分别为94.5%和94.9%)，所以，这3个处理的基质均适宜‘黄花倒水莲’的移栽炼苗.但从管理和基质成本来看，添加一定比例的红壤有助于提高基质的保水性，减少补水次数，还可以降低基质的成本.因此，实际生产栽培过程中建议使用处理4的红壤∶腐殖土∶珍珠岩=1∶1∶1基质配比，成活率达94.5%(图4).

表8　不同基质对黄花倒水莲炼苗的影响Tab.8　The influence on P.fallax seedlling exercising in different matrix

表中同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05).

图4　‘黄花倒水莲’移栽炼苗Fig.4　P.fallax Hemsl transplanting and exercising

3　讨论

试验结果表明，MS培养基适合‘黄花倒水莲’外植体腋芽诱导，罗万业等[8]，李翠兰等[9]在建立‘黄花倒水莲’离体快繁技术体系时，也选用了同样的培养基.而刘秀芳等[7]则以1/2 MS为基础培养基，附加与本试验相同的激素种类和配比，对黄花倒水莲茎段进行诱导培养，也取得了较理想的效果.MS是一种元素间平衡较好，缓冲能力强的基础培养基[10]，1/2 MS只是将大量元素减半.在腋芽诱导初期，外植体内本身贮存着一定量的能量及营养，甚至这些能量及营养足够或超出诱导腋芽之所需，因此，此类基础培养的选择对腋芽的诱导影响并不大.另外，培养时的条件及取材的基因型不同也会有一定的影响.

增殖培养时发现，随着6-BA浓度的增高，不论是以MS还是经以WPM为基础培养基的培养方案中，不定芽的增殖系数均呈上升趋势.但以1.5 mg/L时最为适宜，超过则增殖系数开始下降，且出现玻璃化现象.这与刘秀芳等[7]的研究结果以及在对同属植物晋产远志进行增殖试验时获得的结果相一致[11].一般情下，TDZ的作用强度要大于6-BA.而试验结果表明，在2种基础培养基中添加0.01、0.03、0.05 mg/L的TDZ，其增殖效果显著不如6-BA的效果.这可能与所添加的TDZ的浓度较低有关.

在生根培养时，添加合理浓度范围的生长素有利用‘黄花倒水莲’芽苗的生根.但是不论任何一种激素配比的培养基，均会产生一定量的愈伤组织.而且这种情况会随着生长素浓度的提高而加剧.试验过程中，往往在高生根率的同时伴随着较多愈伤组织的产生.‘黄花倒水莲’生根培养试验结果表明，在生根培养基中添加一定量的活性炭，能较好地抑制愈伤组织的形成，在后期炼苗时，其根不易断开，有利于提高移栽炼苗时的成活率.这与李翠兰等[9]的研究结果相一致.

已有报道认为，泥炭土∶黄泥土∶珍珠岩=2∶1∶1是较适合黄花倒水莲的炼苗基质，移栽成活率可达92.6%[7].本试验结果显示，红壤∶腐殖土∶珍珠岩=1∶1∶1、腐殖土∶珍珠岩=1∶1、全腐殖土3种基质组合的成活率均高于94%.然而，在全红壤的基质中，移栽数天后，苗木根部变黑并逐渐腐烂，最终大量死亡.推测是基质透气性太差，导致根部无氧呼吸产生酒精，继而造成根部毒害.较多研究表明，试管苗移栽成活率与基质本身的保水、保肥、透气性和自身稳定性密切相关.因此，要求炼苗基质要疏松透气，并具有一定的持水力[12-15].

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(责任编辑李辛)

The technology researchinvitrorapid propagation ofPolygalafallaxHemsl

LI Bin,FEI Xi-tong,TANG Jun-rong, YIN Li-sha, HAN Guo-wei,XIN Pei-yao

(Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest Region of China, State Forestry Administration,Southwest Forestry University,Key Laboratory for Forest Genetic and Tree Improvement & Propagation in Universities of Yunnan Province,Southwest Forestry University,Kunming 650224,China)

【Objective】 Technological systeminvitrorapid propagation ofPolygalafallaxHemsl was studied and established.【Method】 After disinfecting with different methods, the tender stems ofP.fallaxused as explant were inoculated in culture medium of MS+6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.05 mg/L to induce the adventitious buds.Then adventitious buds were inoculated in different culture medium with different kind and concentration exogenous hormonesto to culture.The suitalble proliferation and rooting culture medium ofP.fallaxwere selected by the condition of proliferation and rooting. The rooting seedllings ofP.fallaxwere planted in different matrix to selected the suitable exercising matrix by statistic of survival rate. 【Result】 Better sterilization effect was obtained by the method of disinfected with 75% alcohol for 10 s and 0.1% mercuric chloride for 15 min . The contamination rate was as low as 3.15%. MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L was suitable forP.fallaxproliferation culture, the proliferation confficient was 5.50；1/2 MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.3 mg/L+0.2 g/L activated carbon was suitable forP.fallaxrooting culture. The rooting rate was 96%; The best exercising matrix ofP.fallaxvitro seedlling is laterite∶ humus∶ perlite = 1∶1∶1, the survival rate is 94.5%. 【Conclusion】 The vitro rapid propagation ofP.fallaxwas established triumphantly.

PolygalafallaxHemsl;rapid propagation;technology

李斌(1988-)，男，硕士研究生，研究方向为林木遗传育种与快繁.E-mail：445118715@qq.com

辛培尧，男，副教授，硕士生导师，主要从事林木遗传育种与快繁研究.E-mail：xpytgyx@163.com

西南林业大学云南省高校林木遗传改良与繁育重点实验室开放基金项目(YNGB201503)；云南省林学一级学科博士点建设项目.

2016-03-31；

2016-04-18

Q 943.1

A

1003-4315(2016)04-0037-06