兰州百合枯萎病病原菌的分离鉴定与致病性测定
2016-09-26边小荣师桂英梁巧兰孙鸿强樊生丰陈君良
边小荣，师桂英 ，梁巧兰，孙鸿强，樊生丰，陈君良
(1.甘肃农业大学园艺学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州 730070)
兰州百合枯萎病病原菌的分离鉴定与致病性测定
边小荣1，师桂英1，梁巧兰2，孙鸿强1，樊生丰1，陈君良1
(1.甘肃农业大学园艺学院，甘肃 兰州730070；2.甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州730070)
【目的】 为了明确引起兰州百合枯萎病的病原菌，对兰州百合枯萎病鳞茎及病田土壤进行研究.【方法】 采用组织分离及土壤稀释法进行病原菌分离，回接试验测定致病性，病原菌的培养性状、分生孢子的大小等形态特征鉴定菌种.【结果】 从病株鳞茎上分离得F1、F2、F3、F4共4种镰刀菌，分离频率依次为25%、15%、5%、5%，从土壤中分离出1株镰刀菌F5.经过致病性分析，鳞片刺伤后接种，鳞片发病率达100%，病情指数(DI)分别为85.42、80.83、75.83、64.58、82.08；鳞片无刺伤接种，鳞片发病率分别为85.71%、47.62%、42.86%、19.05%、57.14%，病情指数分别为(DI)分别为53.57、22.62、21.43、9.52、25.00.鉴定结果为 F1:尖孢镰刀菌(Fusarium.oxysporum)、F2：茄病镰刀菌(Fusarium.solani)、F3：三线镰刀菌(Fusarium.tricinctum)、F4:烟草镰刀菌(Fusarium.tabacinum)、F5:禾谷镰刀菌(Fusarium.graminearum).【结论】 尖孢镰刀菌、茄类镰刀菌和禾谷镰刀菌的致病能力较强，为兰州百合枯萎病的主要致病菌.
兰州百合；枯萎病；镰刀菌；致病性
兰州百合(Liliumdavidiivar.unicolor)是百合科百合属川百合的一个变种，狭域分布，仅适合在兰州周边海拨1 800～2 500 m的二阴山区种植，是极具地方特色的甘肃名优蔬菜.兰州百合属于无性繁殖植物，多年生栽培：从母株上收获的一级小种球长成二级种球需要2～3 a，二级种球长成商品百合需要3～4 a.因此，基于其狭域分布及多年生栽培的特点，连作障碍十分严重[1].造成连作障碍的原因很多，其中土传病害与土壤养分失调、植物自身的自毒作用一并被列为三大主要成因[2].兰州百合枯萎病是一种由土传真菌引起的病害，在百合主产区2～4 a百合栽培田普遍发生给生产造成损失.
开展枯萎病病原学研究是进行病原性连作障碍研究的基础.该方面研究在观赏百合有诸多文献报道，梁巧兰等[3]和杨秀梅等[4]认为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum),茄病镰刀菌(Fusariumsolani)是引起观赏百合枯萎病的主要病原菌.Li等[5]首次从观赏百合品种(Sorbonne)枯死植株分离出三线镰孢菌(Fusarium.tricinctum).杨秀梅等[6]对观赏百合枯萎病病原鉴定与ITS序列分析，并采用鳞片接种法对36个百合品种及5个野生种进行枯萎病接种鉴定.
镰刀菌种类很多，其种类分布表现出很强的地域性[7-10].李诚等[11]从甘肃陇东平凉地区采集研究兰州百合枯萎病病株进行病原学研究，认为“百合枯萎病病原菌为尖孢镰刀菌百合专化型(Fusariumoxysporum.f sp.lilii),另外还有茄腐皮镰刀菌(Fusariumsolani(Mart) Sacc)和串珠镰刀菌(Fusariummo-niliformSheldon)，但对病原菌的生物学特性、致病性等诸多基础性问题没提及”.甘肃省临洮县东北部山二阴山区是兰州百合的宜栽地区[12].2013年6、7月恰遇连续阴雨天气，该区域上营乡2～4 a生百合枯萎发病率达到30%以上，给生产造成很大损失.目前对甘肃省临洮县上营乡兰州百合枯萎病未见报道.鉴于此，本试验对从临洮县上营乡采集兰州百合枯萎病植株及土壤进行了病原物的分离鉴定及致病性测定，以期明确其病原学特点，为开展兰州百合病原性连作障碍研究提供技术支撑.
1 材料与方法
1.1病株采集及病原菌的分离
试验分别于2015年5月2日和2015年6月21日，在甘肃省定西市临洮县上营乡包家山村和赵家台村的兰州百合田块(E 103°28′36″，N 35°17′54″，海拔2 250 m,年平均降雨量为461.8 mm，平均气温3.2 ℃，平均无霜期89 d)采集12株病株及土样，用于病原菌的分离.
将带病植株的根、茎、鳞茎的病健交界处病组织剪成约0.3 cm×0.5 cm的小块，75%的乙醇表面消毒30 s，无菌水冲洗4～5次，0.1%的升汞溶液消毒30 s～1 min,无菌水冲洗4～5次，用灭菌滤纸吸干病组织表面水分，五点法置于PDA(马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉20 g、蒸馏水1 L)平板上.土样处理方法是[14]：称取土样 5.0 g 放入盛45 mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，置摇床振荡15 min使土样均匀分散形成土壤悬液，然后按照10倍梯度稀释法进行稀释，吸取100 μL最终稀释液于PDA培养基中涂布均匀，25 ℃恒温箱培养.长出的真菌及时转出，根据菌落颜色和形态进行分类编号，并挑取菌丝于新PDA平板上纯化2～3次.纯化后于PDA斜面带菌落长满斜面4 ℃保存.
1.2病原菌致病性测定
病原菌致病性测定采用鳞片接种法进行，试验设计为5因子(纯化分离得到的5种镰刀菌F1、F2、F3、F4、F5)2水平(刺伤、无刺伤)完全随机试验，共10个处理.每个处理21个鳞片，分7培养皿，每个鳞片接菌饼3块.
鳞片接种方法参考梁巧兰等[3-4]的方法进行.具体是：将供试菌种在PDA平板上培养后，制成直径5 mm的菌片备用.采用健康鳞片,以75%酒精表面消毒,无菌水冲洗，采用伤口接种和无伤接种两种方法进行致病性测定.伤口接种法：用灭菌解剖针在鳞片上刺孔,将带培养基的菌片贴在孔上.以刺孔但不贴菌片的鳞片为对照.无伤接种法：直接将菌片贴在鳞片上.以不接菌片鳞片为对照.
接种10 d后记录发病症状，测量病斑直径(d)，计算病斑占鳞片面积比例.据此将鳞片发病级数划分为5级，分别是：0级，鳞片健康无病斑现象;1级，病斑的大小为0
次重复.
病情指数(DI)=100×[Σ(鳞片发病级数×对应株数)/(鳞片发病的最高级数×总株数)]
1.3病原菌的鉴定
将分离得到的菌株接种在PDA平板上，25 ℃培养3 d后用游标卡尺(十字交叉法，取平均值)测量菌落于PDA平板的直径(生长速率)，生长6 d后观察菌落形态，在XSP-2C显微镜下观察菌丝及分生孢子的形态和生长情况.根据菌落直径、大型分生孢子的形态及产生方式、小型分生孢子的有无及产生方式、厚垣孢子的有无及产生方式等为主要形态特征，主要依据《镰刀菌属》[15]、《真菌鉴定手册》[16]、《尖孢镰刀菌生物学及其生物防治》[17]等工具书，利用其检索表进行鉴定.
A：田间发病症状；B、C：地上部茎叶受害症状；D：地下鳞茎发病症状；E、F、G：植株不同发病程度. 图1 兰州百合枯萎病症状Fig.1 Symptoms of Lanzhou Lily wilt
2 结果与分析
2.1兰州百合枯萎病的症状
枯萎病也称为根腐病、茎腐病，是一种镰刀菌引起的病害.镰刀菌从百合肉质根或鳞茎盘基部伤口侵入，造成肉质根和基盘变褐腐烂，并逐渐向上发展，鳞片出现褐色凹陷病斑，变成黄褐色逐渐腐烂，导致鳞片从基盘散开而剥落.由病鳞茎长出的植株明显矮化，植株生长缓慢，植株不能向上运输养分，受害叶片呈牛皮纸样，叶片发黄、萎焉自下而上逐渐枯萎，后枯萎而死(图1).
该病害在临洮县东北部山二阴山区4月中旬左右开始发病，低温高湿的条件下病斑扩展迅速，5月上旬发病数量急剧上升，5月中旬达到高峰期，5月下旬植株大量死亡和枯萎；6～7月持续发生，6月雨水多时发病数量急剧上升，造成根部腐烂，地上部黄化、枯萎死亡.
2.2病原菌的分离
从12株枯萎病病株中分离得到4种病原菌.土壤中只分离到了一株病原菌F5，其他病原菌未分离成功.病株中真菌分离情况见表1.
表1 兰州百合枯萎病病原菌的分离Tab.1 The isolations of Lanzhou lily wilt disease pathogen
2.3病原菌的致病性测定
5种病原菌接种到鳞片上发病症状相似.在刺伤接种情况下，百合鳞片发病率均为100%，病情指数(DI)依次为85.42、80.83、75.83、64.58、82.08；无刺伤时，5种菌的发病程度不同，发病率依次为85.71%、47.62%、42.86%、19.05%、57.14%.通过病情指数计算，5种病原菌的致病性强弱依次为F1>F5>F2>F3>F4(图2-3).
2.4病原菌的鉴定
根据形态学特征进行检索，5种镰刀菌分别为F1:尖孢镰刀菌(Fusarium.oxysporum)、F2：茄病镰刀菌(Fusarium.solani)、F3：三线镰刀菌(Fusarium.tricinctum)、F4：烟草镰刀菌(Fusarium.tabacinum)、F5：禾谷镰刀菌(Fusarium.graminearum).(表1，图1).5种镰刀菌中，尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌和烟草镰刀菌在12 h的光暗交替下可以产生大量的孢子.三线镰刀菌在石竹叶片的诱导下能够产孢，但产孢量极少.禾谷镰刀菌长时间放置(约25 d)时产生了大量的孢子.
A：未刺伤；未接菌；B：未刺伤，接菌发病初期；C：未刺伤，接菌发病后期；D：刺伤，未接菌；E：刺伤，接菌发病初期；F：刺伤，接菌发病后. 图2 兰州百合枯萎病病原菌接种后的鳞片症状Fig.2 Symptom of bulbs after vaccination Lanzhou Lily wilt disease pathogen
A：未刺伤；未接菌；B：未刺伤，接菌发病初期；C：未刺伤，接菌发病后期；D：刺伤，未接菌；E：刺伤，接菌发病初期；F：刺伤，接菌发病后. 图3 兰州百合枯萎病5种病原菌刺伤接种和无刺伤接种后的鳞片病情指数Fig.3 Disease index of bulbs after stabbing and no stabbing vaccination 5 kinds of pathogen of Lanzhou Lily wilt
3 讨论与结论
本试验从兰州百合枯萎病病株及病田土壤中分离得到了5种病原菌，5种镰刀菌均可导致鳞片发病，致病性强弱依次为F1>F5>F2>F3>F4.李诚等[11]从兰州百合病株上分离得到尖孢镰刀菌百合专化型(Fusariumoxysporum.fsp.lilii)，茄腐皮镰刀菌(Fusariumsolani(Mart)Sacc)和串珠镰刀菌(Fusariummo-niliforSheldon)等3种镰刀菌[11]，但对分离物并未做致病性测定.冯昱人等[18]报道了百合枯萎病病原菌的分离鉴定及致病性测定，认为兰州百合枯萎病是由尖孢镰刀菌(F.oxysporum)等3种镰刀菌引起，但在文章表述却以观赏百合作为研究对象，文中还有多处语焉不详，因此研究结果不与其比较.
表2 5种兰州百合枯萎病致病菌的形态学特征描述Tab.2 The description of morphology features of five kinds of Lanzhou Lily wilt disease pathogen
A、B、C、D、E分别代表尖孢镰刀菌(Fusarium.oxysporum)、茄病镰刀菌(Fusarium.solani)、三线镰刀菌(Fusarium.tricinctum)、烟草镰刀菌(Fusarium.tabacinum)、禾谷镰刀菌(Fusarium.graminearum)；1、2分别代表5种菌菌落的正面与背面，3和4分别代表40×10倍镜下5种菌的显微形态；Ⅰ：大型分生孢子，Ⅱ：小型分生孢子，Ⅲ：厚垣孢子，B4、D4、A4：厚垣孢子的着生方式，Ⅳ：产孢细胞. 图4 5种兰州百合枯萎病致病菌菌落形态和显微形态特征Fig.4 Colony shape and micromorphology features of 5 kinds of Lanzhou Lily wilt
本研究分离鉴定获得了5种镰刀菌.其中F.oxysporum在PDA培养基上生长的菌落颜色与黎永坚等[19]、郭立佳等[20]、陈霞[21]所描述的菌落颜色一致，分生孢子的大小形态与李诚等[11]、冯昱人等[18]、杨秀梅等[6]、顾龙云[22]、白丽艳等[23]、魏志刚[24]、刘小娟[25]、梁巧兰等[3]的研究一致，则F1可以确定为F.oxysporum，而F.solani的菌落颜色描述有差异，这可能是由于地域环境的差异所导致的.F3在PDA、PSA培养基上的菌落颜色及PSA大、小型分生孢子的形态、大小、隔膜数与冯昱人分离出来的Fusarium.tricinctum的描述十分接近，Fusarium.solani的分生孢子的形态特征与梁巧兰等[3]的研究基本一致.Fusarium.graminearum的菌落颜色及分生孢子的特征与白丽艳等[23]的研究结果很接近，烟草镰刀菌仅根据《镰刀菌属》和《真菌鉴定手册》鉴定，未能找到其他文献支持，只能为初步确定.
兰州百合枯萎病可引起植物的根腐、茎腐、茎基腐、叶腐等病害.本研究仅从鳞片及土壤中获得了病原菌并进行了致病性测定，对病株根、地上茎及叶片发病组织部位未能获得病原菌，该方面的工作尚需深入进行.
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(责任编辑赵晓倩)
Isolation and identification of wilt disease pathogen from Lanzhou lily and its pathogenicity
BIAN Xiao-rong1,SHI Gui-ying1,LIANG Qiao-lan2,SUN Hong-qiang1,FAN Sheng-feng1,CHEN Jun-liang1
(1.College of Hoticulture,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070，China；2.College of Pratacultural Science,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070，China)
【Objective】 To determine the pathogens which causing wilt disease of Lanzhou lily from of Lintao County,Gansu Province,and to evaluate the bulb and pathogenic soil of this area.【Method】 Isolation and identification of pathogen by the method of tissue separation and soil dilution,and the tieback test to determine pathogenic.【Result】 A total of 5 Fusarium isolates that 4 species (F1,F2,F3,F4) were isolated from Lanzhou Lily bulbs，isolated frequency were 25%,15%,5% and 5%.One (F5) from soil were identified based on methods of isolation,purification,morphological characters and pathogenicity.The disease incidences reached 100% and the disease indexes of five pathogens were 85.42,80.83,75.83,64.58,82.08 by bulbs wound inoculation,respectively.The disease incidences of the bulbs were 85.71%,47.62%,42.86%,19.05%,57.14% and the disease indexes of five pathogens were 53.57,22.62,21.43,9.52,25.00 by no-wound inoculation,respectively.Morphological characters showed that strains F1,F2,F3,F4,F5were respectively identified asF.oxysporum,F.solani,F.tricinctum,F.tabacinumandF.graminearum.【Conclusion】F.oxysporum,F.graminearumandF.solanihad higher pathogenicity than others,these are major pathogens of Lanzhou lily wilt disease.
Lanzhou lily；wilt；Fusarium；pathogenicity
边小荣(1987-)，女，硕士研究生,主要从事蔬菜生理及栽培技术研究.E-mail:1282608450@qq.com
师桂英，女，博士，教授，硕士生导师,研究方向为蔬菜栽培与生物技术.E-mail:shigy@gsau.edu.cn
甘肃省农牧厅农业科技创新项目(GNCX-2013-36)；甘肃省高等学校基本科研业务费项目.
2015-12-09；
2016-03-22
S 644.1
A
1003-4315(2016)04-0058-07
