孙茂桐，李际红，任 静，秦永健，卢 洁，孟凡志*

(1.山东农业大学，山东 泰安 271018； 2.山东省林业保护和发展服务中心，山东 济南 250014)

‘巴茨拉’(Paeonia (Itoh Group) ‘Bartzella’)属于芍药组(Paeonia Sect.Paeonia)与牡丹组(Paeonia Sect.Moutan) 植物杂交所培育出的一类组间远缘杂交种， 又称伊藤杂种 (Paeonia Itoh)[1]。 ‘巴茨拉’ 兼具芍药(Paeonia lactiflora Pall.)的生长特性和牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)的花形特征，有明显的杂种优势，具有花大而艳丽，株型饱满，抗逆性强的特点[2]。 另外，‘巴茨拉’具有罕见的黄色花色，是公认最美的伊藤杂种，具有极高的观赏价值和经济价值[3]。

由于‘巴茨拉’主要依靠嫁接和分株的方式进行繁殖，导致其繁殖系数较低和培育周期较长[4]，而组织培养作为一种高效的无性繁殖方式是实现‘巴茨拉’产业化生产的理想手段。 目前对‘巴茨拉’再生体系的研究主要集中在丛生芽诱导方面[5]，而对愈伤组织诱导方面研究较少。 愈伤组织具有较高的再生能力，可被诱导直接分化或先诱导体胚再分化成苗，是进行再生体系研究的良好材料[6]。 因此探索高效稳定的愈伤组织诱导方法对推动‘巴茨拉’组培快繁及离体再生研究具有一定的理论和实践意义。

近年来，国内外学者对‘巴茨拉’同属的芍药和牡丹愈伤组织诱导进行了大量研究。 刘蓉等[7]以‘凤丹’幼胚作为外植体诱导出愈伤组织，并证明H2O2对愈伤组织诱导具有促进作用。蒲艳[8]以‘滇牡丹’叶柄作为外植体筛选出2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA 的激素组合对诱导愈伤组织效果最佳。 刘广甫[9]以芍药品种‘粉玉奴’茎段为材料进行愈伤组织诱导研究时发现不同的光质对愈伤组织诱导具有显著影响，红光对愈伤组织诱导最有利。

然而目前伊藤杂种在这方面的研究较少，且由于其芽生于地下的生长习性[10]和酚类物质含量高的生理特点[7]在无菌体系建立阶段具有诸多困难。 因此本研究以鳞芽、茎段、叶柄、嫩叶作为外植体探究‘巴茨拉’的无菌体系建立及愈伤组织诱导方法。 为后续‘巴茨拉’的组培快繁提供一定的理论和实验支撑。

1 材料与方法

1.1 植物材料

2020年12月从山东农业大学林学实验站大田挖出‘巴茨拉’带有鳞芽的根茎，一部分鳞芽被立即切下作为外植体；另一部分被埋藏在基质中，于实验室内暗培养，待抽生黄化嫩枝后取嫩叶、叶柄、茎段3 部分与鳞芽一起作为实验中的四类外植体(图1)。

图1 茎段、嫩叶、叶柄、鳞芽外植体（图中比例尺为2 cm）Figure 1 Stem segment, young leaves, petiole and scale bud explants

1.2 实验方法

1.2.1 升汞不同处理时间对外植体的灭菌效果

使用洗涤剂清洗四种外植体表面， 后在流水下冲洗1 h， 置于超净工作台中使用酒精处理20 s， 再在0.1%的升汞中浸泡灭菌，为了对比不同升汞(0.1%)处理时间的灭菌效果，设置3 min、5 min、8 min、12 min 4 个处理时间，最后使用无菌水冲洗3～4 次后接种到不含激素的培养基中，培养14 d 后统计不同外植体的污染率及存活率。

1.2.2 褐化抑制剂对不同外植体褐化率及存活率的影响

为探究褐化抑制剂种类及浓度对茎段、叶柄、叶片3 种外植体褐化率的影响，选择AC(活性炭)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、Vc(抗坏血酸)3 种褐化抑制剂并分别设置3 种不同浓度，AC(0 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L)、Vc(0 mg/L、5、10 mg/L)、PVP(0 mg/L、500 mg/L、1000 mg/L)，使用L9(33)正交表安排共9 种处理，每个处理重复3 次，每次重复接种嫩叶、叶柄、茎段各20～25 个，培养30 d 后统计褐化率及存活率。

1.2.3 激素对不同外植体愈伤组织诱导的影响

为探究激素种类及浓度对茎段、叶柄、嫩叶3 种外植体愈伤组织诱导率及诱导出的愈伤组织质量的影响，将3 种外植体分别接种到添加2,4-D 或6-BA 的培养基中，两种激素各设置3 个浓度2,4-D(0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L)、6-BA(0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L)，共计6 种处理，每个处理重复接种3 次，每个重复接种20～25 个外植体。 培养4 周后统计愈伤组织诱导率并调查愈伤组织质量。

1.2.4 不同形态外植体愈伤组织诱导的表现

为探究将外植体处理成不同形状后对愈伤组织出现时间和愈伤组织量的影响，选择茎段外植体，将其分别横切成4～5 mm 厚的薄片、纵剖成1 cm 长的小段，2 种形状的茎段外植体接种到添加1.0 mg/L 6-BA 的愈伤组织诱导培养基中，每种形状接种20～25 个，重复3 次。 分别在5 d、20 d、45 d 时调查愈伤组织诱导情况并拍照。

1.3 统计及分析方法

使用单因素方差分析(p＜0.01)，以Duncan 法进行差异显著性分析，所有分析均使用SPSS 进行。

褐化率%=褐化的外植体数/接种的外植体数×100

存活率%=存活的外植体数/接种的外植体数×100

诱导率%=诱导出愈伤组织的外植体数/接种的外植体数×100

1.4 培养条件

实验中使用的基本培养基均为1/2MS 培养基， 添加琼脂7 g/L、 蔗糖30 g/L， 调节pH 为5.8，121℃/0.1Mpa 灭菌20 min。 培养室温度为25±1℃，光照时间为16 h/d，光照强度2000 1x。

2 结果与分析

2.1 0.1%升汞不同处理时间对外植体的污染率的影响

由图2 可知灭菌时间对不同外植体污染率及褐化率的影响不同。其中鳞芽灭菌效果最差，升汞处理12 min鳞芽外植体仍有46.67%的污染率， 存活率仅有28.86%，故认为鳞芽不适合进行愈伤组织诱导。与鳞芽相比茎段和叶柄灭菌效果较好， 升汞处理3 min后只有26.66%和20.0%的污染率，继续提高处理时间能够继续降低污染率但其存活率也会明显下降，因此茎段和叶柄适宜处理时间为3 min。 为保证嫩叶有足够高的成活率，升汞处理时间最长可选择8 min，此时污染率能够降低到18.86%，因此嫩叶适宜的升汞处理时间为8 min。

图2 4 种外植体不同灭菌时间下的污染率及存活率Figure 2 Contamination rate and survival rate of four explants under different sterilization time

从灭菌难度的角度来说鳞芽不适宜用来进行愈伤组织诱导，而茎段、叶柄、嫩叶灭菌效果较为理想可用来进行愈伤组织诱导，且最适0.1%升汞处理时间分别为3 min、3 min、8 min。

2.2 褐化抑制剂对不同外植体褐化率及存活率的影响

在添加有褐化抑制剂的培养基中3 种外植体的褐化程度均低于对照，且不同褐化抑制剂对外植体褐化的抑制效果不同(见图3)。 其中添加AC(活性炭)对茎段和嫩叶褐化的抑制作用与未添加相比均不明显，只有在叶柄外植体中，添加1.0 g/L 的AC可使其褐化率降低16.31%；而添加500 mg/L 的PVP (聚乙烯吡咯烷酮)能够使3 种外植体的褐化率大幅降低，但浓度提高到1000 mg/L 并不能继续降低褐化率；与PVP 相比Vc(维生素c)对3 种外植体褐化的抑制效果有明显的剂量效应，随着其添加浓度的提高褐化率具有进一步降低的趋势。

图3 3 种外植体在各处理中的褐化率Figure 3 Average Browning rate of three kinds of explants in each treatment

由此可知， 添加500 mg/L 的PVP 及15 mg/L Vc 能够显著降低3种外植体的褐化率， 而1.0g/L 的AC可有效抑制叶柄褐化。

2.3 激素对不同外植体愈伤组织诱导的影响

接种30 d 后，3 种外植体在不同培养基中均能诱导出愈伤组织， 但3种外植体在不同培养基中的愈伤组织诱导率不同。 由表1 可知3 种外植体均在Y2 培养基中具有最高的愈伤组织诱导率且显著高于其他水平，在此培养基中茎段、叶柄、叶片的愈伤组织诱导率分别为81.72%、84.95%、68.82%。 由图4 可知在最佳培养基Y2 中3 种外植体愈伤组织生长速度和愈伤组织量不同，5 d 时3 种外植体均未产生愈伤组织，15 d 时茎段和嫩叶已产生少量愈伤组织而叶柄尚未产生愈伤组织，30 d 时3 种外植体均已产生愈伤组织，其中茎段和叶柄产生的愈伤组织量明显大于嫩叶，因此认为茎段和叶柄更适合用来进行愈伤组织诱导。

表1 不同激素浓度下三种外植体的愈伤组织诱导率Table 1 Callus induction rate of three explants under different hormone concentrations

2.4 不同形态外植体愈伤组织诱导的表现

由图5 可知，接种5 d 时薄片状外植体形成层已有愈伤组织形成，而段状外植体尚未形成愈伤组织。 接种20 d 时薄片状外植体的愈伤组织已沿形成层产生一圈愈伤组织突起，而段状外植体刚刚开始形成愈伤组织。接种45 d 时薄片状外植体和段状外植体均已形成大量愈伤组织，其中薄片状外植体已被完全被愈伤组织包裹，而段状外植体仅一端产生愈伤组织团。

图5 不同形状茎段外植体接种5d、20d、45d 时的愈伤组织诱导情况(图中比例尺为0.5 cm)Figure 5 Callus induction of stem segment explants with different shapes after inoculation for 5d, 20d and 45d

3 结论与讨论

3.1 褐化抑制剂对不同外植体褐化率及存活率的影响

褐化会严重影响植物材料的脱分化及再分化能力，褐化发生的最主要原因为伤口中多酚类物质与多酚氧化酶接触，在酶促的作用下多酚类物质转化为醌类物质影响植物生长[11]。因此影响褐化的一个主要因素就是外植体的伤口大小[12]，而在3 种外植体中茎段和叶柄的伤口最大因此更易褐化。

本实验选择了3 种褐化抑制剂：Vc(维生素C)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、AC(活性炭)，并安排了9 个处理的实验对他们的褐化抑制作用进行比较。 其中PVP 对茎段、叶柄、嫩叶的褐化率具有明显抑制作用，这样与国外在芍药中的实验结果一致[13]。 而不同浓度AC 仅仅只对叶柄影响较大，对茎段、嫩叶影响不大，这可能是由于AC 抑制褐化是通过物理吸附作用，作用另2 种化学试剂导致[14]。 Vc 通过抑制醌类物质氧化发挥作用，其对茎段、叶柄、嫩叶的褐化率均有较大影响。

3.2 激素对不同外植体愈伤组织诱导的影响

本研究通过单因素实验筛选出对3 种外植体最佳的愈伤组织诱导培养基为1/2MS+1.0mg/L 6-BA，在此培养基中3 种外植体的愈伤组织诱导率分别为81.72%、84.95%、68.82%。 不同的外植体在愈伤组织诱导过程中的表现不同，茎段和叶片愈伤组织出现的时间较叶柄更早，这可能是由于嫩叶和茎段处于较早的发育阶段，响应激素变化的速度更快[15]。 茎段和叶柄相比叶片愈伤组织产生的面积更大，茎段和叶柄整个横断面均可产生愈伤组织，而嫩叶仅有叶脉的伤口处产生愈伤组织。

3.3 不同形态外植体愈伤组织诱导的差异

已有证据表明在植物的组织培养过程中外植体的形状对其再生效果具有重要影响[16]。 本研究通过比较段状和薄片状2 种形状的外植体在愈伤组织诱导过程中的表现，得出薄片状比段状更适合进行愈伤组织诱导。推测将外植体切割成不同形状会影响其与培养基的接触方式，以及外植体的伤口大小。外植体与培养基接触面积越大会更有利于其吸收水分和营养物质，还会使其更好地接受激素刺激。