宋火元

（深圳园林股份有限公司，广东深圳 518000）

蝴蝶兰（Phalaenopsis spp.）隶属于兰科蝴蝶兰属，主要分布于热带和亚热带地区，因其株形优雅，花色艳丽，受到广大市民的喜爱，在世界范围内广泛应用，具有极高的经济价值[1-3]。

蝴蝶兰为气生兰，自然条件下存在种子萌发率低、形状分离严重等问题[4，5]，因此蝴蝶兰扩繁主要采取植物组织培养的方式，既能保证蝴蝶兰种质性状的稳定，又能实现工厂化生产。在植物组织培养所要求的无菌生长环境下，外植体脱毒效果的好与坏关系到整个蝴蝶兰种苗扩繁的生产及后续种苗的品质。

春节过后，蝴蝶兰苗场会在节后一次性剪掉未售出的开花株的花梗，组培室可以以较低的成本获得蝴蝶兰组织培养扩繁所需的外植体。往往一次性剪下的蝴蝶兰花梗数量较大，如果组培室的生产错过了花梗的最佳接种时期会浪费大量的人力物力，合理地安排好接种扩繁工作可以更好地控制生产成本、提高产品产出。以6 个蝴蝶兰品种的外植体为研究对象，研究外植体获取时间和接种时间间隔（即保存时间）以及升汞消毒时间对外植体脱毒效果的影响，以期为蝴蝶兰扩繁产业提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料获取

本试验选取了6 个不同品种的蝴蝶兰（表1），在同一时间内分别剪下其开花的花梗放入无菌蒸馏水中，选择生长健壮、无变异、无损伤的花梗，剪成约6～8cm 的长度以获取外植体，保证外植体上切口为直角平切、切口平滑。每个外植体保留1 个饱满、有活力的芽点，除去覆盖在芽点上的薄衣。用75%医用酒精棉对每个外植体进行擦拭干净后，将花梗末端放入深2cm 的无菌蒸馏水中，每天更换无菌蒸馏水直至整个组培生产过程的完成。

表1 本研究使用的蝴蝶兰品种

1.2 试验方法

试验采用随机单因素设计，每个处理选取不同的蝴蝶兰品种外植体各5 个，共30 个，设3 次重复。试验分为7 个步骤：（1）将外植体放入细口烧瓶中，每瓶10个，加入75%的医用酒精，摇动烧瓶30s，倒掉酒精，用无菌蒸馏水冲洗5 次；（2）第1 次倒入0.1%升汞，不间断摇动烧瓶；（3）倒掉升汞，用无菌蒸馏水冲洗8 次，取出外植体，切掉两端约0.5cm，重新放入烧瓶中；（4）第2 次倒入0.1%升汞，不间断摇动烧瓶；（5）倒掉升汞，用无菌蒸馏水冲洗10 次，取出外植体，切掉两端约0.5cm后将外植体放入培养基中；（6）每瓶培养基放入1 个外植体，外植体长度为5cm 左右，深度以芽点不能没入培养基；（7）将培养基放入封闭无菌环境的培养室中，温度控制在20～25℃之间，光照时间为10h，光照强度为1600Lx。

每个处理均使用同一批次生产的蝴蝶兰扩繁培养基，培养基为：MS+6-BA 6mg/L+NAA 2mg/L+ 椰汁20mL/L+牛肉蛋白胨5g/L。

1.2.1 不同外植体消毒处理设置。对升汞消毒时间设置了5 个梯度，即5 个处理，分别为：处理Ⅰ第1 次升汞消毒6min，第2 次升汞消毒8min；处理Ⅱ第1 次升汞消毒7min，第2 次升汞消毒9min；处理Ⅲ第1 次升汞消毒8min，第2 次升汞消毒10 min；处理Ⅳ第1 次升汞消毒9 min，第2 次升汞消毒11min；处理Ⅴ第1 次氯化汞消毒10min，第2 次升汞消毒12min。

1.2.2 不同外植体保存时间设置。将外植体保存时间设置7 个梯度，分别为保存时间为1d、2d、3d、4d、5d、6d、和7d。

1.2.3 后期管理。接入培养基后每天进行观测，半个月后结束试验，统计污染率和成活率。

2 结果与分析

2.1 不同消毒处理对蝴蝶兰外植体脱毒效果的影响

不同消毒处理的蝴蝶兰外植体污染率如表2 所示。可以看到，在选取的蝴蝶兰外植体保存时间一致的情况下，外植体污染率随升汞消毒时间的增加呈逐渐下降的趋势，使用升汞消毒时间越长污染率越低；外植体成活率随升汞消毒时间的增加呈先上升后下降的趋势，在消毒时间为16min 时成活率最高，当消毒时间达到22min 时，外植体成活率降为0%。综合来说，使用升汞消毒16min 时效果最佳，在保持较低污染率的同时有着较高的成活率。

2.2 蝴蝶兰外植体保存时间对脱毒效果的影响

蝴蝶兰外植体保存时间对脱毒效果的影响如表2所示。可以看到，在同一消毒时间处理下，蝴蝶兰外植体即保存时间越长污染率越高，外植体现取现用（1d内）时污染率为0，保存时间超过1d 后外植体开始出现污染，保存时间超过5d 后使用升汞已无法将其完全消毒，当保存时间超过7d 污染率达到100%。同时，外植体保存时间越长其成活率也越低，在保存时间不超过2d 时外植体有较高的成活率，当外植体保存超过6d 再植入培养基已无法成活。综合来说，组织培养使用现取的外植体可获得最佳的效果。

表2 不同消毒处理方法及保存时间对蝴蝶兰外植体脱毒效果的影响

3 讨论与结论

外植体的带菌状况对组织培养的成败有着重要的影响，影响培养物的建立和生长[6]，因此对外植体采取有效的消毒处理措施是组织培养中的关键步骤[7]。酒精和升汞可以使蛋白质脱水变性达到消毒效果，是植物组织培养中常用的消毒试剂[8]。但是酒精和升汞处理时间过长会对外植体产生一定伤害，甚至使外植体失活，影响组织培养的效果，因此选取合适的消毒处理方法至关重要。本研究表明，0.1%升汞对蝴蝶兰外植体有明显的消毒效果，但是处理时间过长后升汞残留较多，其毒性影响了外植体的生长，在消毒时间超过22min时外植体甚至完全失活。因此在通常情况下使用升汞消毒时需将时间严格控制在16min，具体时间控制还需根据外植体的大小、类别、取样时间等进行调整[9]。

蝴蝶兰外植体的保存时间长短也是外植体扩繁成功的关键因素，保存时间过长外植体的污染率逐渐上升，成活率显著下降，降低了工作效率，增加了投入成本，减少了产品产出。因此在用蝴蝶兰花梗做外植体进行组织培养扩繁时应合理安排时间，外植体应在剪取2d 内完成接种，最好做到现取现用。