吴思雅,阿衣木古丽·艾赛提,郑灿龙,朱　璇

(新疆农业大学食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐 830052)



新疆赛买提杏采后主要病原真菌的分离及鉴定

吴思雅,阿衣木古丽·艾赛提,郑灿龙,朱璇*

(新疆农业大学食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐 830052)

本文采用新疆赛买提杏为材料,常规组织分离法得到引起采后腐烂的主要病原真菌有3类,通过形态学及rDNA-ITS序列克隆分析的方法对其进行鉴定。研究发现:引起新疆赛买提杏采后腐烂的主要病原菌有3类,分别为交孢链格孢(Alternariaalternata)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)和皮落青霉(Penicilliumcrustosum)。本研究可为杏贮藏保鲜及病害的防治提供理论依据和技术指导。

赛买提杏,采后病害,病原菌鉴定,形态特征,ITS

杏(Prunusarmeniacal)属蔷薇科(Rosaceae),李属(Prunoideae),属于呼吸跃变型果实。据2014年新疆统计年鉴所示[1],新疆杏的种植面积约13.58 hm2,产量达140.69万t,占全疆水果总面积的18.70%、总产量的23.53%。赛买提杏营养丰富,既可以制干也可以鲜食,深受广大消费者喜爱,是新疆杏树的主摘品种之一,但是杏后熟期短,果实采后易腐烂变质,造成严重的经济损失。杏采后腐烂损失主要是由病原微生物侵染引起的[2]。通过形态学初步鉴定认为,引起杏采后腐烂的病原菌主要有链格孢(Alternariasp.)、青霉(Penicilliumsp.)、根霉(Rhizopussp.)。近年来,随着分子生物学的发展,利用PCR扩增病原菌核糖体ITS(Internal Transcribed Spacer)基因区段进行病原菌鉴定技术广泛应用于枣、柑橘、甜瓜、樱桃、香梨等园艺产品采后病原菌的鉴定中[3-6],此方法从分子水平上对病原菌进行了准确鉴定,为控制园艺产品采后病害提供理论依据。目前,国内外对杏采后病害的研究主要集中在防治方法的探索上,对引起杏果实采后病害的主要病原真菌的鉴定还未见相关报道,本研究采用形态学和分子生物学技术对新疆赛买提杏病原菌进行鉴定,为病害的进一步防治提供理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

PDA培养基:称取200 g马铃薯,洗净去皮切成小块,加入1000 mL水煮沸30 min,纱布过滤,再加葡萄糖20 g,琼脂20 g,121 ℃,灭菌15 min。

超净工作台苏州净化设备厂;YXQ-SG46-280S高压灭菌锅上海博讯实业有限公司;生化培养箱江苏南通五金电器厂;XSP-2CA显微镜厦门Motic实业集团有限公司;型号Biometra Tprofessional PCR仪。

1.2实验方法

1.2.1新疆赛买提杏采后病原菌的分离纯化参考方中达方法[7],采集典型发病的赛买提杏果实,切取病健交界处组织放置于70%酒精溶液中浸泡约30 s,以杀灭所带杂菌,然后置于无菌水中冲洗3次,将冲洗干净的组织移置到PDA培养基上,于26 ℃恒温培养。待菌落生长到1 cm时用接种针刮取菌的边缘,移植在新的培养基上,划线培养,直到形成单一菌种。

采用稀释纯化法,菌落平板内加20 mL灭菌水,轻轻摇晃,倒入灭菌烧杯内,加30 mL灭菌水稀释,取一滴在显微镜下观察,不断稀释到每一小滴悬液中只有一个孢子,用灭菌水冲洗到培养基上,静置10 min后,倒去多余的悬液,放在适合的条件下培养。

1.2.2新疆赛买提杏采后病原菌的鉴定

1.2.2.1病原菌的形态学鉴定根据病原菌在杏果实上的发病症状及病原菌在PDA上菌落特征,菌丝形态,分生孢子形态,大小和数量,分生孢子梗形态特征,厚垣孢子的有无、形态和大小等,参照魏景超[8]《真菌鉴定手册》对病原菌进行形态学鉴定。

1.2.3病原菌的分子生物学鉴定

1.2.3.1病原菌DNA的提取按照上海生物工程Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(SK8259)的说明提取。

1.2.3.2rDNA-ITS序列的扩增根据姚子鹏等[9]的报道,扩增ITS区(以ITS1:5′-TCCGTAGGTGA ACCTGCGG-3′和 ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3′为引物)的 rDNA 序列,反应体系 50 μL(5 μL PCR buffer(10×PCR buffer),5 μL dNTPs(5.0 mmol/L)(全式金),1 μL模板DNA,上下游引物各1 μL,0.25 μL Taq(全式金),加dd H2O至50 μL。PCR程序:94 ℃预变性5 min后,30个循环包括94 ℃ 50 s,51 ℃ 50 s、72 ℃ 2 min,72 ℃延伸10 min。反应完成后,-20 ℃保存备用,0.8%琼脂糖电泳检测。将PCR产物纯化后直接测序(测序由上海生物工程有限公司完成)。将获得的基因序列在NCBI数据库进行BLAST。

2　结果与讨论

2.1新疆赛买提杏采后病原菌形态学鉴定结果

2.1.1病原菌A形态学鉴定病原菌A在杏果实上的发病症状为病斑较硬,略凹陷,表面有褐色或者黑色孢子霉层。菌株在PDA平板上,初为灰白色,气生菌丝薄层絮状,产孢后为浅绿色至褐色,有明显的轮纹,培养一周的菌落直径为69～86.2 mm。分生孢子串生,孢子倒棍型或长卵型,具有柱状的喙。分生孢子梗单生,分枝或不分枝,浅褐色,有隔2～7个,长21.5～59.2μm。参照魏景超[8]《真菌鉴定手册》初步鉴定为链格孢属(Alternariasp.)。

图1　病原真菌A的形态及培养性状Fig.1　Form and culture character of pathogenic fungi A

2.1.2病原菌B形态学鉴定菌株B可在果实表面或内部发病,先形成褐色水渍斑,之后生出白色菌丝,然后长出青色或绿色霉层,最后导致全果腐烂。病原菌菌落呈蓝绿色;菌丝有隔单核,分生孢子梗直立,顶端1至多次分枝呈扫帚状,分枝上产生3轮不对称的瓶状小梗,其顶端着生成串的分生孢子,球形,呈念珠状,一般成串相连,孢子直径2～3 μm。参照魏景超[8]《真菌鉴定手册》初步鉴定为青霉属(Penicilliumsp.)。

图 2　 病原真菌B的形态及培养性状Fig.2　Form and culture character of pathogenic fungi C

2.1.3病原菌C形态学鉴定菌株C在杏果实上的发病症状最初出现茶褐色小斑点后迅速扩大,邻近果实也极易发病,1～2 d后,病部变软呈水浸果实,全面发生大量棉絮状菌丝,有光泽的长条形霉,接着产生黑色孢子。在培养基上培养病原菌,菌丝生长迅速,3 d就能充满培养皿整个空间菌落黑灰色;有发达的假根和匍匐枝,菌丝无隔,孢囊梗较长,自假根伸出单根而不分枝,末端突入孢囊内与孢囊相接,1～10枝丛生于假根上;孢子囊为球形,孢囊孢子形状不规则,孢子大小10～20 μm,参照魏景超[8]《真菌鉴定手册》初步鉴定为根霉属(Rhizopussp.)。

图3　病原真菌B的形态及培养性状Fig.3　Form and culture character of pathogenic fungi C

2.2新疆赛买提杏采后病原菌rDNA-ITS序列分析

为了进一步确定三种菌的种名,采用rDNA-ITS[10]分子鉴定法对这三种菌株进行分析。经琼脂糖凝胶电泳检测,分离得到的3种真菌的PCR反应体系产物均为单一条带,如图4所示。

图4　病原菌的ITS扩增电泳图Fig.4　Amplification Electrophoretogram of fungi’s ITS注:M为DNA Marker;1～3分别为A～C病原真菌的ITS扩增产物。

以病原真菌DNA为模板,经通用引物扩增而得到长度约为540 bp和750 bp左右的 rDNA-ITS序列。把所得到序列提交到GeneBank数据库,进行BLAST比较,菌株A的ITS序列与Alternariaalternata(JF835807.1)同源性为99%,菌株B的ITS序列与P.crustosum(DQ875021.1)同源性99%,菌株C的ITS序列与Rhizopusstolonifer(JX241668.1)同源性为100%。

2.3讨论

果蔬在采后贮藏期间由于病原真菌侵染而造成的腐烂是导致其损失的主要原因。传统病原菌的鉴定方法主要根据形态特征、分生孢子梗及菌落形态来进行分类,然而由于许多病原菌形态特征难以获得及其培养性状的可变性,此方法具有一定的局限性,存在着需要经验,耗时较长等问题。与传统的形态学鉴定相比,利用PCR扩增病原菌rDNA-ITS基因序列在病原真菌的鉴定中具有简便快捷,准确性高等优点。

本实验通过传统形态学和分子生物学相结合的方法,从发病的杏果实中分离鉴定出引起赛买提杏果实采后病害的三种菌株,分别为A.alternata、P.crustosum和R.stolonifer。近年来,从贮藏的杏果实中分离出A.alternata和R.stolonifer已有资料报道,贾盼盼[2]等的研究中指出A.alternata、P.expansum和R.stolonifer是引起新疆杏果实采后病害的主要病原菌;张瑾等[11]发现引起兰州大接杏采后病害的病原菌主要有A.alternata、常现青霉(Penicilliumfrequentans)、黑根霉(Rhizopusnigricans)等;而P.crustosum作为杏采后致病菌还未见报道,但Wang等[12]在苹果曾分离出P.crustosum。研究表明,不同年份不同地区不同品种及不同栽培和贮藏条件的果实,引起其采后病害的病原菌种类也存在一定差异[13-14]。本研究从发病的赛买提杏果实分离鉴定出P.crustosum也反映出这一特点。对引起水果采后腐烂的病原菌进行准确鉴定是进行病害研究的前提条件,而且对有效开展病害防治工作具有重要意义。

3　结论

以新疆赛买提杏为主要原料,对其采后主要病原真菌的鉴定,得出以下结论:

通过形态学和分子生物学相结合的方法,从发病的杏果实中分离鉴定出引起赛买提杏果实采后病害的三种菌株,分别为A.alternata、R.stolonifer和P.crustosum,但是由于病原果实取材范围较窄,若想全面地揭示引起杏果实采后病原菌的种类和优势菌株等问题,需要进一步扩大采样范围,且随着分子生物学的迅猛发展,对杏果实主要病原菌更深入的研究将成为可能,对延长果实贮藏保鲜具有重要意义。

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Identification of main pathogenic fungus from post-harvest “Saimaiti”apricot fruits

WU Si-ya,Ayimuguli.aisaiti,ZHENG Can-long,ZHU Xuan*

(College of Food Science and Pharmacy,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China)

Xin Jiang “Saimaiti” apricots were taken as the experimental material in this paper. Three pathogenic fungus which was obtained from the decay apricots were identified by morphological method and rDNA-ITS sequence analysis. The result showed thatAlternariaalternate,Penicilliumcrustosum,Rhizopusstoloniferawere three main post-harvest fungus of apricot fruits. The research may provide theoretical and technology guide for prolong storage period and disease control of apricot fruits.

Apricot;diseases;identification of pathogens;morphological characteristics;ITS

2015-05-13

吴思雅(1993-),女，硕士,主要研究方向：果蔬贮藏与保鲜，E-mail: wsy930218@sina.com。

朱璇(1971-)，女，博士，教授，主要研究方向：果蔬贮藏与保鲜，E-mail：zx9927@126.com。

国家自然科学基金项目(31460414)；公益性行业(农业)科研专项(201303075)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000