张　颖　李　涢　张　杰　刘梅洁　赵宏艳　潘静华　鞠大宏

(首都医科大学附属北京潞河医院中医科，北京　101149)



基于蛋白质组学方法研究左归丸治疗去卵巢所致骨质疏松症大鼠的作用机制※

张颖李涢1张杰1刘梅洁1赵宏艳1潘静华1鞠大宏△

(首都医科大学附属北京潞河医院中医科，北京101149)

目的基于蛋白质组学方法研究左归丸治疗去卵巢所致骨质疏松症大鼠的作用机制，进而为阐明“肾主骨”理论的科学内涵寻找实验依据。方法将60只雌性Wistar大鼠随机分为2组，正常对照组20只和造模组40只。造模组大鼠通过摘除双侧卵巢建立绝经后骨质疏松症(PMOP)模型，正常对照组大鼠只摘取卵巢周围的少许脂肪组织。手术2周后，再将40只造模组大鼠随机分为模型组及左归丸组，各20只。左归丸组予左归丸水煎剂灌胃，正常对照组及模型组予等容积蒸馏水灌胃。给药3个月后，比较3组大鼠胫骨骨小梁体积百分比(TBV%)水平，取大鼠双侧股骨骨髓进行蛋白质双向电泳并对电泳图谱进行分析，筛选出左归丸干预的相关蛋白,并进行质谱分析鉴定。结果模型组、左归丸组大鼠胫骨TBV%水平低于正常对照组(P<0.05)，左归丸组大鼠胫骨TBV%水平高于模型组(P<0.05)。3组大鼠共筛选出23个差异蛋白质点，其中12个蛋白质点由于蛋白质分数不具有统计学意义而未得到鉴定，11个蛋白质点得到鉴定。检索数据库显示10号差异蛋白质点alpha-enolase为α-烯醇化酶，其免疫组化法检测显示模型组α-烯醇化酶阳性表达密度高于正常对照组(P<0.05)，而左归丸组α-烯醇化酶阳性表达密度低于模型组(P<0.05)，这与双向凝胶电泳图谱分析和质谱鉴定结果相一致。结论左归丸可能通过调节骨髓内与细胞增殖、分化、代谢、凋亡及氧化反应等相关蛋白质来实现对PMOP的防治作用，这些差异蛋白质可能与PMOP的发生发展具有一定的相关性。

骨质疏松，绝经后；左归丸；蛋白质组学；大鼠；动物；实验

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是一种与衰老有关的常见病，主要发生于绝经后妇女，是由于雌激素缺乏导致的骨量减少，骨密度降低，骨结构变化，使骨脆性增加而易发骨折的一种代谢性疾病[1]。中医学认为，肾藏精，主骨生髓，肾阳虚衰，则不能充骨生髓，肾阴亏损，精失所藏，不能养髓，致使骨松不健[2]。左归丸是中医具有代表性的补肾方剂之一，具有滋阴补肾、填精益髓的功效。本实验在以往研究工作的基础上[3]，以卵巢切除大鼠作为PMOP动物模型，用左归丸进行干预，采用蛋白质组学方法探索产生的具有调节作用相关蛋白，以期从蛋白水平揭示补肾方剂左归丸对PMOP的作用机制，进而为阐明“肾主骨”理论的科学内涵提供进一步的实验依据。

1　材料与方法

1.1实验动物选用雌性无特定病原体(SPF)级Wistar大鼠60只，体质量190～220 g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供[许可证号：SCXK-(军)2007-004]，均在中国中医科学院中医基础理论研究所清洁级实验动物室内饲养[实验动物室许可证号：SYXK(京)-2010-0032]。

1.2实验药物左归丸方药组成：熟地黄24 g，山药12 g，枸杞子12 g，山茱萸12 g，牛膝9 g，菟丝子12 g，龟版胶12 g，鹿角胶12 g。常规水煎制浓缩，浓度为生药0.968 g/mL。此药物浓度按照人日用临床剂量，经人-大鼠体表面积比值折算,浓缩8倍而成[4]。

1.3主要试剂及仪器

1.3.1试剂丙烯酰胺(美国Amrsco公司，批号：0341)；甲叉双丙烯酰胺(美国Amrsco公司，批号：0172)；三(羟甲基)氨基乙烷(美国Amrsco公司，批号：0497)；十二烷基硫酸钠(美国Sigma公司，批号：L5750)；乙二胺四乙酸二钠(美国Amrsco公司，批号：0105)；四甲基乙二胺(美国Amrsco公司，批号：0497)；碘代乙酰胺(德国Merck公司，批号：8047440025)；尿素(美国Amrsco公司，批号：0568)；硫脲(美国Amrsco公司，批号：M-226)；固相pH梯度干胶条(美国GE公司，批号：17-1234-01)；IPG胶条缓冲液(美国GE公司，批号：71-5005-82)；蛋白酶抑制剂(德国Roche公司，批号：04-693-124-001)；血清白蛋白标准(美国GE公司，批号：17044601)；Bradford法测定蛋白试剂盒(索莱宝科技有限公司)；考马斯亮蓝R-350(美国GE公司，批号：17-0518-01)。

1.3.2仪器Ettan Daltm等电聚焦系统(美国GE公司)；Ettan Daltsix垂直电泳系统(美国GE公司)；UMAX 2100透射扫描仪(台湾力广科技股份有限公司)；PE Lambda12紫外分光光度计(美国PerkinElmer公司)；Microson超声波细胞破碎仪(美国Misonix公司)。

1.4实验方法

1.4.1动物分组及模型制作将60只雌性Wistar大鼠随机分为2组，正常对照组20只和造模组40只。2组均采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，造模组大鼠摘除双侧卵巢，正常对照组大鼠只摘取卵巢周围的少许脂肪组织[5]。手术2周后，将40只造模组大鼠再随机分为2组，模型组20只和左归丸组20只。

1.4.2给药方法分组后开始对大鼠灌胃给药。左归丸组按生药9.68 g/kg予左归丸水煎剂灌胃，每日1次，连续灌胃6 d，休息1 d后再连续灌胃给药，每周称质量1次，据此调整给药量，共给药3个月。正常对照组、模型组则按同法予等容积蒸馏水灌胃。

1.5观察指标及方法

1.5.1骨小梁体积百分比(TBV%)检测各组大鼠在处死前15 d及前3 d分别腹腔注射盐酸四环素30 mg/kg，以对骨进行荧光标记[6]。给药结束后，将各组大鼠处死，取大鼠右侧胫骨置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，乙醇逐级脱水，二甲苯浸泡2 d。依次在塑料聚合液Ⅰ液、Ⅱ液、Ⅲ液中各浸泡3 d，随后进行塑料包埋[7]，制作不脱钙骨切片，甲苯胺蓝染色，以观察骨小梁体积百分比(TBV%)变化。

1.5.2蛋白质提取取各组大鼠双侧股骨，置于-80 ℃保存备用。取股骨骨髓于eppendorf离心管中，加入0.5 mL组织裂解液(主要由尿素、硫脲、4% CHAPS两性离子去污剂、1%二硫苏糖醇、乙二胺四乙酸二钠配制而成)。同时加入1×Cocktail(混合物)蛋白酶抑制剂。将含裂解液的eppendorf离心管埋入冰中，超声破碎，3～4 s/次，间隔10 s左右，至溶液透明。加入脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)(10 μg/μL)、核糖核酸酶A(RNase A)(10 μg/μL)各5 μL，4 ℃静置30 min后，放入离心机以14 000 r/min离心30 min。取上清液，分装，置于-80 ℃保存备用[8]。

1.5.3骨髓蛋白分析鉴定分别提取正常组、模型组及左归丸组大鼠股骨骨髓蛋白质，应用蛋白质双向凝胶电泳技术分析比较3组大鼠股骨骨髓之间蛋白质的表达，找出各组之间的差异蛋白质点。通过质谱方法对这些差异蛋白质进行进一步鉴定，获取差异蛋白质的肽质量指纹图谱和相关数据库信息。采用免疫组化法验证骨髓中相应蛋白的表达[9]。

2　结　果

2.13组大鼠胫骨TBV%水平比较见表1。

表13组大鼠胫骨TBV%水平比较

组 别nTVB%正常对照组2029.17±4.23模型组2013.29±2.70*左归丸组2019.39±2.83*△

与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

由表1可见，模型组、左归丸组大鼠胫骨TBV%水平低于正常对照组，比较差异有统计学意义(P<0.05)；左归丸组大鼠胫骨TBV%水平高于模型组，比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.23组大鼠股骨骨髓中蛋白质的表达

2.2.1双向凝胶电泳结果双向凝胶电泳图像结果经Image Master 2D Platinum 5.0软件分析，所识别的蛋白质点个数为(826±35)个，以3倍差异表达作为标准，配合人工校正，在正常组、模型组及左归丸组3组之间共找到差异蛋白质点为23个，见图1、图2。

图1　3组大鼠骨髓双向凝胶电泳图谱

图2　3组大鼠骨髓双向凝胶电泳图谱中差异蛋白质点

2.2.23组大鼠差异蛋白质点质谱鉴定结果对23个差异蛋白质点进行酶解、质谱分析得到肽质量指纹图谱后，查询美国国立生物技术信息中心(NCBI)nr数据库(截止至2011-10-14)，其中12个蛋白质点由于数据搜索的蛋白质分数不具有统计学意义而未得到鉴定(≥61分才具有统计学意义)，11个蛋白质点得到鉴定，其中2个蛋白为未知命名蛋白(1号和11号)，见表2。检索数据库显示10号差异蛋白质点alpha-enolase为α-烯醇化酶，图3为α-烯醇化酶的肽质量指纹图谱，图4为α-烯醇化酶的分数直方图。

2.2.3免疫组化法验证3组大鼠股骨骨髓中α-烯醇化酶的表达见图5、表3。

由图5、表3可见，模型组α-烯醇化酶阳性表达密度高于正常对照组，比较差异有统计学意义(P<0.05)；左归丸组α-烯醇化酶阳性表达密度低于模型组，比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表2　11个差异蛋白质点鉴定结果及其表达变化情况

图3　α-烯醇化酶差异蛋白质点的肽质量指纹图谱

图4　α-烯醇化酶差异蛋白质点的分数直方图

图5　3组大鼠股骨骨髓中α-烯醇化酶的表达

组 别n阳性表达密度正常对照组201.254±0.42模型组202.73±0.39*左归丸组201.57±0.27△

与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

3　讨　论

PMOP是临床常见的一种原发性骨质疏松症，主要是由绝经以后雌激素水平急剧下降而引起，因骨量减少和骨组织微结构的异常改变,导致骨密度降低，骨脆性增高,从而表现为骨痛、身长缩短、驼背、骨折及活动障碍等症状，这大大增加了中老年妇女的伤残率及病死率。蛋白质是生命现象的体现者，是生命活动的直接参与者，蛋白质组学是在蛋白质水平上把健康或病理条件下的生命活动规律与其蛋白质组联系起来，以阐明疾病的发病机制、解释药物的作用机制、鉴定疾病分子标志物的一种重要方法[10-11]。

中医学认为，肾藏精，主骨生髓，肾中精气随着年龄增长而由充盛逐渐衰退，骨骼也随之由强健而转为衰弱。PMOP的发生主要原因是肾精亏虚，精不生髓，其本在肾，补肾填精法为其根本大法。左归丸是滋补肾阴的代表方剂，具有滋阴补肾、填精益髓的功效，并较为广泛地应用于骨质疏松症的临床治疗和基础研究。研究表明，左归丸可通过调节骨吸收和骨形成，控制和逆转骨量的丢失，进而使骨量增加[12]；能够对血清中雌激素及雌激素靶器官起到直接的调节作用[13]；通过促进成骨细胞分泌骨钙素，直接抑制细胞核因子-κB受体活化因子配基(RANKL)的分泌，从而促进成骨细胞分泌骨保护素(OPG)，并使之与RANKL的结合增多，进而使破骨细胞活性降低[14-15]；更多的研究还发现，左归丸可通过抑制成骨细胞白细胞介素(IL)-1、IL-6和前列腺素E2的分泌，发挥抑制破骨细胞的活性[16]。本实验结果显示，模型组大鼠胫骨TBV%水平明显低于正常对照组(P<0.05)，说明大鼠PMOP造模成功；左归丸组大鼠胫骨TBV%水平明显高于模型组(P<0.05)，说明左归丸治疗PMOP疗效确切。左归丸对PMOP的干预也必然会影响到骨组织的相关蛋白。本实验采用切除大鼠双侧卵巢的方法建立PMOP的动物模型，以蛋白质组学技术方法为主要研究手段，从股骨骨髓中的差异蛋白质来探索左归丸对去卵巢所致大鼠骨质疏松症的作用机制。本实验结果显示，相对于正常对照组，模型组大鼠骨髓中2、4号蛋白质表达受到抑制，1、3、5、6、7、8、9、10、11号蛋白质表达增多，而左归丸对这些蛋白质的表达均有明显调节作用。这些标志蛋白质主要涉及机体能量代谢、抗氧化、信号转导及细胞分化、增殖、凋亡等方面的功能，说明左归丸可通过调节骨髓细胞增殖、分化、代谢、凋亡及氧化反应等来达到对PMOP的治疗作用。提示这些表达差异蛋白质可能既是药物对PMOP进行预防和治疗作用机制的体现，同样也是PMOP发生发展机制的体现。

烯醇化酶是1934年Lohman和Mayerhof在研究肌肉提取物中磷酸甘油酸向丙酮酸转换的过程中发现的，在细胞能量代谢的过程中起着重要的作用。烯醇化酶存在α、β及γ 3种同功酶。α-烯醇化酶在存在于许多组织中，β-烯醇化酶多见于肌肉组织，γ-烯醇化酶主要存在于神经元和神经内分泌组织中。根据分布和作用的不同，α-烯醇化酶又称为非神经元烯醇化酶(NNE)、enolase1(eno1)、纤维蛋白溶酶原结合蛋白等[17]。烯醇化酶的表达水平和活性会随着组织不同的生理或病理状态而改变。α-烯醇化酶可以通过调节细胞的产能过程，维持细胞三磷酸腺苷(ATP)水平，为细胞的活动提供所需能量，保证细胞存活和正常功能。Poon HF等[18]通过研究发现，小鼠的脑组织中的α-烯醇化酶随着年龄增加表达明显增加，从而推出其与老年脑功能异常有关，因为糖酵解酶的增加可抑制脂肪酸的氧化，损害脑组织细胞的能量代谢。苏友新等[19]研究也发现，中药强骨宝1号可使PMOP模型大鼠股骨皮质骨中烯醇化酶蛋白表达上调。本实验结果显示，在模型组大鼠骨髓中α-烯醇化酶高表达，故推测α-烯醇化酶表达出现异常，损害了骨髓内细胞的能量代谢，影响了细胞的功能，从而诱发了去卵巢大鼠骨质疏松症的发生。而左归丸对α-烯醇化酶蛋白质的高表达有下调作用，这与双向凝胶电泳图谱分析和质谱鉴定结果一致。

综上所述，左归丸可能通过调节骨髓内与细胞增殖、分化、代谢、凋亡及氧化反应等相关蛋白质来实现对PMOP的防治作用。基于中医理论对PMOP的认识，这些差异蛋白可能与PMOP的发生发展具有一定的相关性，从而也为阐明“肾主骨”理论的科学内涵提供了实验依据。

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(本文编辑：石康)

Action mechanism of Zuogui Pill in ovariectomized-induced osteoporotic rats based on proteomics techniques

ZHANGYing*,LIYun,ZHANGJie,etal.

*DepartmentofTraditionalChineseMedicine,BeijingLuheHospitalAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity,Beijing101149

Objective To study the action mechanism of Zuogui Pill in ovariectomized-induced osteoporotic rats based on proteomics techniques, and to provide the experimental evidence of the theory of “Kidney dominating bone”. Methods 60 female Wistar rats were randomly divided into two groups, 20 in normal control group and 40 in molding group. Postmenopausal osteoporosis (PMOP) model was established by removing the bilateral ovaries in molding group, while only a little fatty tissue nearby the ovaries in normal control group were extirpated. Two weeks after operation, 40 rats in molding group were randomly divided into model and Zuogui pill group, 20 in each group. The Zuogui pill group received decoction of Zuogui pills by gavage, the normal control and model group received same dose distilled water by gavage. After three months administration, the percentage of trabecular bone volume (TBV %) of tibia were compared among three groups. The related proteins of Zuogui Pill intervention were selected from the femur bone by means of 2-DE and electrophoretogram, then use for mass spectrometry analysis. Results The TBV % of tibia in model and Zuogui pill groups were lower than that in normal control group (P<0.05), and its in Zuogui pill groups were higher than that in model group (P<0.05). 12 protein spots, which selected from total 23 differential protein spots of three groups, were unrecognized by reason of the protein scores without statistical difference, and other 11 protein spots obtain correct identification. Search databases showed that the NO.10 differential protein spot was alpha-enolase. The positive expression density of alpha-enolase which measured by mmunohistochemistry in model group was higher than that in normal control group (P<0.05), and its in Zuogui pill group was lower than that in model (P<0.05), and the result was in agreement with 2-DE map and mass spectrometry analysis. Conclusion Zuogui pill has preventive and therapeutic effects on PMOP which may be through the regulation of bone marrow's proteins relate to cell proliferation, differentiation, metabolism, apoptosis and oxidation reaction, such differential proteins may be have a positive correlation with occurrence and development of PMOP.

Osteoporosis; Post-menopause; Zuogui pills; Proteomics; Rats; Animals; Experiment

实 验 研 究10.3969/j.issn.1002-2619.2016.07.018

△中国中医科学院中医基础理论研究所，北京100700

张颖(1979—)，女，主治医师，博士。从事中医药防治骨质疏松症的基础研究以及中医内科疾病的临床与研究。

R285.5；R681.4

A

1002-2619(2016)07-1024-06

2016-05-05)

※ 项目来源：国家自然科学基金资助项目(编号：30973691)

1中国中医科学院中医基础理论研究所，北京100700