陈 宁，程 田，王 平，李俊鹏，张延忠，鲁 艺，王晓炜

（1.深圳市药品检验所，深圳 518057；2.华南农业大学兽医学院，广州 510642；3.深圳市瑞鹏宠物医院，深圳 518000）

寄生虫烯醇化酶的研究进展

陈 宁1，程 田2，王 平1，李俊鹏1，张延忠3，鲁 艺1，王晓炜1

（1.深圳市药品检验所，深圳 518057；2.华南农业大学兽医学院，广州 510642；3.深圳市瑞鹏宠物医院，深圳 518000）

烯醇化酶是糖酵解过程中促进磷酸甘油酸和磷酸烯醇式丙酮酸相互转换的重要催化酶，同时也是存在于真核和原核细胞表面的多功能酶。最近研究发现，它能够激活纤溶酶原，参与病原的感染过程，而且也是主要的免疫刺激性蛋白和药物作用靶点。本文综述当前寄生虫烯醇化酶的研究成果，旨在探讨其作为寄生虫病的诊断、潜在候选疫苗及药物靶点的可能性。

寄生虫；烯醇化酶；糖酵解

烯醇化酶（enolase）又称磷酸丙酮酸水合酶（phosphopyruvate hydratase），是一种广泛存在于包括细菌和高等生物体内的高度保守的酶［1］，在糖酵解的第九个步骤中，能促进2-磷酸-D-甘油酸（2-PGA）与磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的相互转化［2］，磷酸烯醇丙酮酸将会经由丙酮酸激酶的催化，使原本接在氧原子上的磷酸根转移到ADP上，进而生成ATP以及丙酮酸，这个反应会放出大量的能量，因此，烯醇化酶在细胞能量代谢中起重要作用。

大多数生物体内的烯醇化酶只有一种形式，但在哺乳动物中它以3种不同形式的组织特异性同工酶存在，分别为α、β、γ型［3］。哺乳动物体内的烯醇化酶通常以二聚体形式存在，而原核生物中则多以八聚体形式存在，如猪链球菌［4］。作为重要的细胞质酶，它存在于很多真核和原核细胞表面，尽管它不具备经典表面蛋白所拥有的信号肽、跨膜区等特点，但还是能够在细胞表面表达［5］，而且能在猪蛔虫的排泄/分泌物（ES）中检测出来［6］。在真核细胞中，它存在于T细胞、B细胞、中性粒细胞和神经细胞的表面。定位于不同位点的烯醇化酶发挥着不同的功能，除了催化糖酵解过程之外，烯醇化酶还参与了多种病原微生物对寄主的组织入侵和转移过程，可以作为疫苗候选因子和药物靶标。近年来，寄生虫烯醇化酶的研究多围绕基因特性、蛋白特性、生物学分析、免疫原性等方面，本文就目前国内外寄生虫的烯醇化酶的研究进展进行综述。

1 原虫烯醇化酶

1.1 疟原虫烯醇化酶 烯醇化酶存在于疟原虫生命周期的每一个阶段。除了细胞质之外，烯醇酶还与细胞核、食物泡、细胞骨架和等离子体膜形成有关。烯醇酶的多样化定位表明，除了在糖酵解的催化作用之外，烯醇化酶可能参与许多其他生物功能。例如，恶性疟原虫裂殖子表面烯醇化酶可能参与红细胞入侵，囊泡中的烯醇化酶可能参与食物泡形成，细胞核烯醇化酶可能在转录中发挥作用［7］。动合子表面烯醇化酶主要具有两个功能：结合到蚊虫中肠上皮来对寄主进行入侵；通过烯醇化酶内部的赖氨酸肽段（DKSLVK）结合动合子表面的纤溶酶原，激活寄主溶纤系统来侵染寄主［8］。Das研究小组2011年构建了恶性疟原虫酿酒酵母的烯醇化酶缺失株Tetr-Eno2，该重组蛋白将Enolase1基因敲除，Enolase2基因的表达受四环素阻遏操纵子的调控。当由于四环素阻遏操纵子的调节造成Enolase2低表达时，Tetr-Eno2缺失株生长缓慢；当加入高浓度的强力霉素（10 μg/mL）时，Tetr-Eno2缺失株停止生长，并且出现空泡碎片和蛋白表达水平的变化。当恢复缺失株的恶性疟原虫烯醇化酶表达水平时，Tetr-Eno2缺失株恢复所有表型变化。这些研究说明恶性疟原虫烯醇化酶对滋养体期的食物纳虫泡的生长发育有重要作用［9］。在恶性疟原虫感染过程中，烯醇化酶可以延缓小鼠的疟原虫的入侵，并且降低小鼠的死亡率［10］。

1.2 弓形虫烯醇化酶 刚地弓形虫编码两个期特异性表达的烯醇化酶（ENO1、ENO2），二者核酸序列及氨基酸序列相似性很高，但是由于各自表达阶段不同的代谢及适应能力使得它们在酶学动力学上有一定的差异。Ruan等［11］发现弓形虫烯醇化酶enolase 1 （TgENO1）存在于缓殖子阶段，enolase 2（TgENO2）存在于速殖子阶段，他获得弓形虫烯醇化酶的enolase 1的晶体结构并对其进行分析，其二级结构为缓殖子期所特有，发现重组烯醇化酶（TgENO1）可以特异性结合TTTTCT片段，结果表明，弓形虫烯醇化酶可以调节基因表达，enolase1可作为潜在药物靶标用于脑弓形虫的治疗。Holmes等［12］用RNA干涉的方法将烯醇化酶eno2 dsRNA导入弓形虫，并成功将eno2基因沉默，在ENO1基因定位上呈现轻微表型变化。

张华景等［13］根据弓形虫已知序列扩增eno2基因，获得eno2基因全长1353bp，编码444个氨基酸，分子量约为55 kDa。Western blot显示，重组蛋白能被感染弓形虫的犬阳性血清识别，说明ENO2具有较好的反应原性，可以作为血清学诊断抗原。随后将获得的重组ENO2作为抗原，免疫BALB/c小鼠获取高免血清后制备特异性强的单克隆抗体，成功筛选出2株特异性单抗。利用获得的单克隆抗体，应用FITC标记的二抗进行间接免疫荧光（indirect immunofluorescence，IFA）实验对ENO2进行组织定位。荧光显微镜观察结果发现，ENO2在速殖子阶段的细胞质及细胞核都有分布，其中细胞核可见较强的荧光信号。通过CFDA-SE标记弓形虫速殖子，流式细胞仪分析ENO2单抗对速殖子入侵Vero细胞的影响，结果发现ENO2单抗抑制了速殖子的入侵，ENO2与弓形虫入侵Vero细胞相关。

1.3 锥虫与利氏曼原虫烯醇化酶 在锥虫和利氏曼原虫体内不同发育期虫体内烯醇化酶的表达水平可能不太相同。Paba等［14］通过指纹图谱检测分析发现，克氏锥虫体内烯醇化酶在锥鞭毛体和无鞭毛体中的表达高于上鞭毛体。Rosenzweig等［15］发现墨西哥利士曼原虫从前鞭毛体到无鞭毛体的分化过程中，糖酵解酶上调表达1.4倍，包括烯醇化酶在内的胞浆糖酵解酶上调表达2倍。

Avilán等［16］认为，尽管布氏锥虫、克氏锥虫和利士曼原虫的烯醇化酶高度保守，并在机体代谢过程中扮演重要角色，但锥虫和宿主烯醇化酶之间仍存在差异，在锥虫烯醇化酶接近活性中心的位置有3个独特的活性残基，可以作为抗锥虫药物研发的靶点。烯醇化酶存在于利士曼原虫的表面分泌蛋白中，因此，可能是潜在的毒力因子作为纤溶酶原的受体参与虫体入侵，它的定位和功能研究将为抗锥虫药物研发和疫苗研制提供新的切入点。

目前发现，烯醇化酶通过两种途径与血纤溶酶原结合：一种方式是烯醇化酶通过其氨基酸序列C端的两个赖氨酸结合纤溶酶原；另一种方式使烯醇化酶以其肽链中部小段结构域与纤溶酶原结合。Vanegas等［17］通过研究墨西哥利士曼原虫烯醇化酶与纤溶酶原的相互作用，发现其序列中的一段肽段（AYDAERKMY）是这两个蛋白结合的关键位点。Swenerton等［18］研究发现，寡肽酶B（OPB）可以调节利士曼原虫体内烯醇化酶的表达，当寄生虫体内的OPB基因被敲除时，烯醇化酶的表达明显升高。另外，Albert等［19］发现，在血液中的布氏锥虫的烯醇化酶可以作为RNA干涉（RNAi）的作用靶标，由于RNAi干涉作用，在最初的24h，烯醇化酶的酶活力减少到16%，并且出现锥虫发育延缓现象，2d后出现死亡。

1.4 球虫和隐孢子虫烯醇化酶 刘立恒［20］发现柔嫩艾美耳球虫烯醇化酶在未孢子化卵囊阶段丰度小于孢子化卵囊阶段，且在两个时期均能恒定表达。他采用免疫蛋白组学方法，对鸡柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊可溶性蛋白的免疫原性进行了系统分析，发现烯醇化酶可被抗血清识别，具有免疫原性。

杨晓娇［21］成功获得微小隐孢子虫的烯醇化酶序列，运用亲和层析分离纯化目的蛋白，以纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔，制备抗重组蛋白的多克隆抗体，通过SDS-PAGE分析表明重组Enolase能被高效地表达。Western blot分析结果显示纯化的融合蛋白能被兔阳性血清和His-Tag mouse mAb识别，表明融合蛋白具有良好的反应原性。ELISA检测结果显示，经重组蛋白3次免疫后，兔血清多克隆抗体的效价达1:51200，与兔肌烯醇酶没有交叉反应性，提示该多克隆抗体具有很好的特异性。

1.5 泰勒虫烯醇化酶 Cayir等［22］认为烯醇化酶可作为治疗泰勒虫的大分子靶标，他将环形泰勒虫烯醇化酶的内含子序列去掉后进行克隆表达，获得同源二聚体形式的烯醇化酶纯化蛋白，并对其结构和动力学参数进行分析，所获得的烯醇化酶的动力学数据和结构特征为今后研究设计针对抗泰勒虫药物奠定了基础。

2 线虫烯醇化酶

2.1 捻转血矛线虫烯醇化酶 Han等［23］获得捻转血矛线虫烯醇化酶（enolase）基因的1583bp全长序列，含有最大开放阅读框（open reading frame，ORF），为1305 bp，5-非翻译区（5'-UTR）长62 bp，3-非翻译区（3'-UTR）长216 bp，SDS-PAGE结果分析发现融合蛋白在上清和包涵体中均有表达，分子量约49 kDa。以自然感染的山羊血清作为一抗，Western blot结果显示在49 kDa处出现特异性条带，与推测ORF的蛋白大小近似。酶活性测定结果表明该重组蛋白具有一定的烯醇化酶催化活性。

Kalyanasundaram等［24］比较捻转血矛线虫体内烯醇化酶重组蛋白（rHcENO）和ConA纯化自身糖蛋白的免疫预防作用，发现二者均能刺激机体IgG水平升高，且ConA纯化自身糖蛋白的免疫保护性比重组烯醇化酶（rHcENO）稍高。

2.2 猪蛔虫烯醇化酶 Chen等［25］获得了猪蛔虫烯醇化酶的全长序列，通过RNAi研究发现，猪蛔虫幼虫烯醇化酶由于RNAi的作用被沉默，并出现幼虫生长被抑制。通过构建烯醇化酶pVAX-Enol真核表达质粒，肌肉注射免疫昆明小鼠。研究结果显示，pVAX-Enol cDNA疫苗免疫昆明小鼠可有效地诱导产生体液免疫和细胞免疫反应，结果显示疫苗具有一定的免疫保护作用，能够有效地提高昆明小鼠抗猪蛔虫感染能力［26］。

2.3 广州管圆线虫和旋毛虫烯醇化酶 Zhang等［27］通过对烯醇化酶定位研究，发现广州管圆线虫烯醇化酶大多存在于虫体细胞质中，如壁肌肉、生殖道、神经环和消化道中等能量消耗比较大的部位，并不像预期的表皮和真皮层。这表明广州管圆线虫烯醇化酶可能参与其他的生物功能，而不是作为纤溶酶原的受体或者分泌性抗原组分。烯醇化酶也在细胞核中表达，表明它可能参与机体生长和发育过程的调节。尽管广州管圆线虫曾寄生于宿主血管中，但由于烯醇化酶不存在于L3幼虫和成虫的表面，表明它可能有其他的入侵和免疫逃避机制。

Bien等［28］筛选肌肉旋毛虫和成虫旋毛虫体内可能存在的免疫反应性蛋白，通过液相质谱鉴定得到的18个蛋白中，有3个蛋白在成虫和幼虫体内较为常见：烯醇化酶、热休克蛋白及5'端核苷酸酶，它们在旋毛虫感染时可能扮演重要角色，刺激机体产生体液免疫应答，因此对于旋毛虫的早期诊断及疫苗研究有重要意义。

3 吸虫烯醇化酶

Wang等［29］发现华枝睾吸虫烯醇化酶（Csenolase）存在于华枝睾吸虫的成虫、后囊蚴、尾蚴和虫卵四个生命阶段中，在成虫中高表达。免疫组化显示，它存在于成虫的皮肤和后囊蚴的囊壁上，当抗华枝睾烯醇化酶血清抑制酶活性时，华枝睾烯醇化酶表现出活跃的酶活性催化反应。体外培养试验显示，Csenolase可能在寄生虫的生长中起着关键作用，作为一种潜在的候选疫苗和药物靶标。Wang等［30］进一步研究发现，通过RNA干涉使华枝睾吸虫烯醇化酶沉默表达，沉默效果对华枝睾吸虫成虫产生致死作用。Wang等［31］利用大肠杆菌和枯草芽孢杆菌构建华枝睾吸虫烯醇化酶（Csenolase）的基因工程疫苗，发现二者均能诱导机体体液免疫，有一定程度的减虫率和减卵率，烯醇化酶可作为候选口服疫苗而进一步研究。

Manneck等［32］为寻找甲氟喹在血吸虫体内的结合蛋白，研究其药物靶标，分析甲氟喹通过抑制烯醇化酶而干扰糖酵解的过程，对血吸虫童虫在葡萄糖存在或不存在情况下，研究甲氟喹和3种已知糖酵解抑制剂（即氟化钠、3-溴丙酮酸和甲萘醌）的代谢抑制作用。发现由于葡萄糖的存在，血吸虫童虫受甲氟喹、氟化钠和3-溴丙酮酸影响较小，当童虫接触到甲萘醌时葡萄糖失去保护作用。这些结果表明甲氟喹可以作为潜在的糖酵解抑制剂，烯醇化酶可能作为潜在的抗吸虫药物靶标。

邱春辉等［33］对日本血吸虫的烯醇化酶做了相关研究，指出该酶能在虫体的表膜进行表达，他们对血吸虫烯醇化酶进行表达，并将重组蛋白免疫小鼠，获得24.28%的肝组织减卵率和21.45%的粪便减卵率，具有部分免疫保护效果。

4 绦虫烯醇化酶

Gan等［34］获得细粒棘球绦虫1449 bp的全长序列，包含分别位于78 bp和69 bp的两个内含子序列，该基因编码433个氨基酸，预测其氨基酸序列中含有一段跨膜区（aa104～aa124）。

对绦虫烯醇化酶的免疫学特性分析发现该酶含有大量线性B细胞表位和细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）表位。在这些表位中有2个重要肽段，即aa49和aa228～aa236。这两个肽段均同时含有B细胞和CTL表位，分别位于跨膜区的两侧，能刺激体液免疫和细胞免疫应答。无论这种蛋白质的拓扑结构如何变化，它均可介导绦虫对宿主的免疫刺激作用。说明烯醇化酶具有较好的免疫诊断和疫苗应用前景。

赵国雄等［35］利用在线分析工具设计引物并扩增得到细粒棘球蚴序列，通过Swiss-Model建模分析烯醇化酶的3D结构，推测其可能是一个位于虫体表层表膜具有较好免疫诊断和疫苗应用前景的膜蛋白，同时还能进入细胞核调节基因表达。王莹等［36］从细粒棘球绦虫cDNA中扩增目的基因并进行表达，利用细粒棘球蚴病及其他几种寄生虫病患者的血清和健康人血清，通过ELISA法评价重组EgEno抗原的免疫诊断效果。重组EgEno可被细粒棘球蚴病患者血清识别，表明重组EgEno对细粒棘球蚴病有较好的免疫诊断价值。

王利晓等［37］采用Real time PCR技术，对扩展莫尼茨绦虫在虫体的不同发育阶段烯醇化酶基因表达的差异进行了检测，发现基因的表达量与虫体生命活动的旺盛程度明显呈正相关，该酶在头节、孕节、幼节和成节不同发育阶段上表达水平有显著差异，并推测该烯醇化酶基因在虫体寄生过程中对细胞内物质的代谢与能量的产生起关键作用。夏党荣等［38］对扩展莫尼茨绦虫烯醇化酶进行原核表达分析，Westernblot结果表明，天然蛋白能够被重组表达产物免疫小鼠的血清识别，出现两条免疫印记条带，天然蛋白能够被重组表达产物免疫小鼠的血清识别，出现两条免疫印记条带，即天然蛋白以两种形式（约47 kDa和40 kDa）存在，并具有抗原性，为该蛋白功能研究奠定了基础。

黄艳等［39］应用生物信息方法从亚洲带绦虫成虫cDNA文库中筛选出了亚洲带绦虫烯醇酶cDNA全长序列，并预测得到其结构与功能方面信息。杜武英等［40］对亚洲牛带绦虫成虫烯醇化酶基因进行原核表达，发现重组蛋白具有较强的免疫原性，并定位在虫卵的卵壳和胚膜上。戴佳琳等［41］和刘玉江等［42］分别对牛带绦虫和猪带绦虫烯醇化酶基因结构和编码区序列进行分析，对其蛋白特性、二级结构、三维空间构像等进行生物信息学分析。尤亚南等［43］获得猪带绦虫的烯醇化酶全长序列，并进行原核表达，表达产物可被猪囊尾蚴病阳性血清识别，并发现该重组蛋白具有纤溶酶原结合特性及酶活力，推测猪带绦虫烯醇化酶可能在寄生虫入侵宿主过程中发挥作用，有作为药物靶标或疫苗候选分子的潜力。

综上所述，烯醇化酶是大多数体内寄生虫糖酵解中的关键酶之一，与寄生虫的生存密切相关。烯醇化酶作为纤维蛋白溶酶原受体蛋白，被认为是寄生虫重要的致病因子之一，同时它具有较好的免疫原性，并可能作为候选疫苗或治疗药物靶标。对该酶的深入研究，将有助于人们进一步认识其在寄生虫的感染与免疫调节、能量代谢中的作用，为发展潜在的疫苗候选分子和有效的治疗诊断方法奠定基础。

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RESEARCH PROGRESS ON ENOLASE OF PARASITES

CHEN Ning1， CHENG Tian2， WANG Ping1， LI Jun-peng1， ZHANG Yan-zhong，LU Yi1， WANG Xiao-wei1
（1. Shenzhen Institute for Drug Control， Shenzhen 518057， China； 2. College of Veterinary Medicine， South China Agricultural University，Guangzhou 510642， China； 3. Shenzhen Ruipeng Pet Hospital，Shenzhen 518000， China）

Enolase， an important glycolytic enzyme that catalyses the conversion of phosphoglycerate to phosphoenolpyruvate， was identified as a multifunctional protein on the surface of most eukaryotic and prokaryotic cells. Recent studies have revealed that this enzyme could activate the plasminogen，involving in the processes of parasite infection. It is also considered to be a major immunostimulatory protein and drug target. This paper reviews the current research results in parasite enolase， and explores its potential for diagnosis， vaccine candidate and drug targets of parasitic diseases.

Parasite； enolase； glycolytic

S 852.7

A

1674-6422（2015）04-0081-06

2015-05-07

深圳市科技研发资金知识创新计划项目（JCYJ20130402144215888）

陈宁，女，博士，主要从事动物寄生虫病的防控

陈宁，E-mail:cn82cn@163.com