黄树宣　朱飞奇△　裴中　朱瑾华　杨志　邓旭辉　刘远



·论著·

小檗碱对颅脑创伤模型小鼠对侧顶叶皮层继发性损伤的影响☆

黄树宣*朱飞奇*△裴中※朱瑾华*杨志*邓旭辉*刘远*

目的观察小鼠颅脑创伤(traumatic brain injury，TBI)后对侧皮层的炎症反应、氧化损伤及神经元丢失的情况，并探讨盐酸小檗碱对这种继发性损害的影响。方法采用自由落体撞击法建立TBI小鼠模型，通过灌胃给予盐酸小檗碱[50mg/(kg·d)],共21 d。采用免疫荧光染色观察对侧顶叶皮层小胶质细胞、星形胶质细胞的增殖活化情况，免疫组化染色观察对侧皮层COX-2(cyclooxygenase-2)、iNOS(inducible nitric oxide synthase)的表达情况以及DNA氧化损伤和神经元丢失的情况。结果TBI导致对侧顶叶皮层小胶质细胞和星形胶质细胞的增殖活化、COX-2和iNOS的表达以及DNA氧化损伤较对照组明显增加，分别为(19.82±1.88)和(16.96±1.69)、(13.79±4.32)和(8.67±0.96)、(27.86±5.38)和(16.00±7.59)、(31.92±6.57)和(24.79±2.78)(P<0.01或P<0.05)，但神经元数量无显著丢失，分别为(49.05±4.38)和(48.56±3.56)(P>0.05)；小檗碱显著抑制对侧皮层小胶质细胞、COX-2和iNOS的表达，分别为(15.49±1.88)和(19.82±1.88)、(16.83±7.89)和(27.86±5.38)、(26.25±2.41)和(31.92±6.57)(P<0.01或P<0.05)，而星形胶质细胞和DNA氧化损伤的比较差异无统计学意义，分别为(11.91±1.42)和(13.79±4.32)、(32.82±2.78)和(34.40±2.41)(P>0.05)。结论TBI导致远隔对侧顶叶皮层继发性损害较轻，仅导致炎症反应、氧化损伤增加，但并不会导致远隔对侧皮层神经元丢失；盐酸小檗碱能够显著抑制TBI后对侧皮层的炎症反应。

颅脑创伤盐酸小檗碱对侧皮层炎症反应氧化损伤神经元丢失

炎症反应和氧化损伤是颅脑创伤(traumatic brain injury，TBI)后继发性脑损害病理生理机制的重要环节，炎症反应可以加重氧化损伤，氧化损伤又可加重炎症反应，两者可形成恶性循环[1，2]。因此，如何减轻TBI后的炎症反应和氧化损伤是当前治疗TBI的研究热点。小檗碱，又称黄连素，近年来研究发现其具有抗炎、抗氧化、降低胆固醇等多种药理作用，在神经系统多种疾病中发挥着重要的保护功能[3]。本研究将盐酸小檗碱应用在TBI模型小鼠上，观察TBI模型小鼠对侧皮层的炎症反应、DNA氧化损伤及神经元丢失的情况，同时探讨盐酸小檗碱对这种远隔皮层继发性损害的影响，为小檗碱用于治疗TBI后继发性损害提供有力的依据。

1　材料与方法

1.1研究对象6月龄的健康雌性C57BL/6小鼠18只，采购于中山大学实验动物中心，饲养于中山大学北校区实验动物中心。小鼠随机分为对照组(Control)、模型组(TBI)、小檗碱组(TBI+Berberine)，每组各6只。将盐酸小檗碱溶于生理盐水中，配成小檗碱生理盐水混悬液，参考Durairajan[4]等研究，小檗碱组灌胃给予盐酸小檗碱(50 mg/kg)，每天1次，共21 d。主要试剂和仪器：盐酸小檗碱(美国Sigma公司)；骨蜡(美国强生公司)；兔抗GFAP单克隆抗体(英国Abcam公司)；兔抗Iba1单克隆抗体(日本Wako公司)；兔抗iNOS多克隆抗体(美国Proteintech公司)；兔抗COX-2多克隆抗体(美国Bioworld公司)；兔抗NEUN单克隆抗体(英国Abcam公司)；山羊抗8-OHdG多克隆抗体(美国Calbiochem公司)；生物素化的驴抗山羊IgG(美国Life公司)；生物素化的抗兔IgG(美国Dako公司)；Alexa Fluor 555标记的山羊抗兔荧光二抗(美国Life公司)；二氨基联苯胺(3’,3’N-diaminobenzidine tertrahydrochloride, DAB)(美国Dako 公司)；抗荧光淬灭封片剂(美国Sigma 公司)；颅脑创伤撞击器(北京拜安吉科技有限公司)；脑立体定位仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；小鼠颅骨钻(韩国世新公司)；冰冻切片机(德国莱卡公司 CM1950)；正置组织(荧光)显微镜(日本Olympus公司)。

1.2小鼠颅脑创伤模型的制作按Feeney[5]法制作TBI模型。以4.2%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，头皮去毛消毒后从正中切开一长约1.5 cm的切口，暴露颅骨，在矢状缝旁左侧、冠状缝和人字缝之间开一直径约5 mm的骨窗，保持硬脑膜的完整性，用20 g的砝码从高度20 cm处垂直自由下落撞击。撞击后用骨蜡封闭骨窗，消毒后缝合头皮。每次撞击前均先消毒撞击针头。模型组和小檗碱组小鼠接受手术过程，对照组只接受切开头皮暴露颅骨和开一直径约5 mm的骨窗，然后用骨蜡封闭消毒缝合头皮。

1.3脑组织灌注和冰冻切片TBI模型建立后第21天，以4.2%水合氯醛麻醉后，经心脏多聚甲醛溶液灌注固定，断头取脑，置于新配置的4%多聚甲醛溶液12 h，依次置入20%、30%蔗糖4℃梯度脱水， OCT(optimal cutting temperature compound)包埋剂包埋脑组织后，在恒冷冰冻切片机上作冠状位连续切片，切片厚10 μm。

1.4免疫组化染色取出切片，枸橼酸微波中火修复5 min，0.3% Triton X-100破膜30 min，0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次，3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶15 min，抗原封闭液封闭1 h，滴加一抗兔抗iNOS多克隆抗体或兔抗COX-2多克隆抗体或兔抗NEUN单克隆抗体或山羊抗8-OHdG多克隆抗体(1∶200)4℃过夜，0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次，滴加二抗生物素化的驴抗山羊IgG或生物素化的抗兔IgG常温孵育1 h，0.01 mol/L PBS清洗5 min×4次，DAB显色1 min，苏木素复染3 min，中性树胶封片，显微镜下拍照。每只小鼠取3张大致相同层面的切片，观察撞击对侧顶叶皮层大致相同位置COX-2、iNOS、NEUN和8-OHdG的阳性细胞数，显微镜下随机取5个视野(400×)计数阳性细胞数。

1.5免疫荧光染色取出切片，枸橼酸微波中火修复5 min，0.3% Triton X-100破膜30 min，0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次，抗原封闭液封闭1 h，滴加一抗兔抗GFAP单克隆抗体或兔抗Iba1单克隆抗体(1∶500)4℃过夜，0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次，滴加二抗Alexa Fluor 555标记的山羊抗兔荧光二抗(1∶500)避光37℃孵育1 h，0.01 mol/L PBS漂洗5 min×4次，含DAPI抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下避光拍照。每只小鼠取3张大致相同层面的切片，观察撞击对侧顶叶皮层大致相同位置GFAP、Iba1的阳性细胞数，在显微镜下随机取5个视野(200×)计数阳性细胞数。

2　结果

2.1小胶质细胞和星形胶质细胞计数各组之间对侧皮层小胶质细胞和星形胶质细胞数量的比较差异有统计学意义(F=8.764,P=0.003；F=5.591,P=0.015)。对照组小胶质细胞(Iba1阳性)数量为16.96±1.69；模型组小胶质细胞数量增多，为19.82±1.88，与对照组比较差异有统计学意义(P=0.016)；小檗碱组小胶质细胞数量为15.49±1.88，与模型组比较差异具有显著的统计学意义(P=0.001)，见表1、图1A。对照组星形胶质细胞(GFAP阳性)数量为8.67±0.96，模型组为13.79±4.32，与对照组比较差异有统计学意义(P=0.005)；小檗碱组星形胶质细胞数量为11.91±1.42，与模型组比较差异无统计学意义(P=0.245)，见表1、图1A。

2.2COX-2和iNOS的表达各组之间对侧皮层COX-2和iNOS阳性细胞数的比较差异有统计学意义(F=5.299,P=0.018；F=4.493,P=0.03)。对照组COX-2阳性细胞数为16.00±7.59；模型组COX-2阳性细胞数增多，为27.86±5.38，与对照组比较差异有统计学意义(P=0.011)；小檗碱组COX-2阳性细胞数为16.83±7.89，与模型组比较差异有统计学意义(P=0.016)，见表1、图1B。对照组iNOS阳性细胞数为24.79±2.78；模型组iNOS阳性细胞数为31.92±6.57，与对照组比较差异有统计学意义(P=0.012)；小檗碱组iNOS阳性细胞数为26.25±2.41，与模型组比较差异有统计学意义(P=0.039)，见表1、图1B。

2.38-OHdG的表达和神经元计数各组之间对侧皮层8-OHdG阳性细胞数的比较差异有统计学意义(F=20.795,P<0.001),神经元数量的比较差异没有统计学意义(P>0.05)。对照组8-OHdG的阳性细胞数为25.16±2.75；模型组8-OHdG的阳性细胞数为34.40±2.41，与对照组比较差异有显著的统计学意义(P<0.001)；小檗碱组8-OHdG的阳性细胞数为32.82±2.78，与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表1、图1C)。对照组、模型组、小檗碱组NEUN的阳性细胞数分别为48.56±3.56、49.05±4.38、47.75±4.14，各组之间的比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表1、图1C)。

3　讨论

TBI根据其病理生理过程可分为原发性脑损伤和继发性脑损伤，前者持续时间短暂，临床干预方法非常有限，而后者持续时间可达数小时至数月，是目前临床治疗TBI的重要切入点[6]。在本研究中，我们侧重观察TBI后对侧皮层的继发性脑损害，并探讨盐酸小檗碱对这种继发性脑损害的影响。我们发现在TBI模型建立后第21天，模型组小鼠损伤对侧皮层的小胶质细胞、星形胶质细胞的增殖活化和炎症因子COX-2、iNOS的表达以及DNA的氧化损伤依然较对照组显著增加，这与BALU[7]等报道继发性脑损害在TBI后可持续数周的结果是一致的，同时表明TBI后第21天继发性脑损害不仅可以出现在原发的撞击部位，还可以出现在远隔的其他部位。炎症反应和氧化损伤是导致TBI后继发性脑损害的重要因素，小胶质细胞和星形胶质细胞是中枢神经系统炎症反应的主导细胞，前者可以释放氧自由基、一氧化氮、炎性细胞因子等加重神经损伤[8]，后者不仅可以释放炎症因子，还可以在损伤区域形成胶质瘢痕，对轴索的修复和再生形成机械性的阻碍屏障[9]。环氧化酶(cyclooxygenase-2，COX-2)和诱导型的一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)都是炎症反应的关键酶，COX-2能够导致TBI后大脑皮层和海马齿状回的神经元死亡，iNOS在脑缺血、TBI以及神经退行性疾病中通过释放一氧化氮导致神经元的损伤[10]。TBI后的氧化损伤则包括氧自由基的释放、脂质过氧化、DNA和蛋白质损伤等，均可以导致神经元死亡[2]。8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine，8-OHdG)是较理想的DNA氧化损伤的生物标记物，我们发现TBI可导致对侧皮层8-OHdG阳性神经元显著增加，表明TBI可导致对侧皮层氧化损伤显著增加。但是，在我们的研究中，在对侧皮层神经元丢失数量的比较上是没有统计学意义的，这可能是由于我们TBI模型的制作方法不同，撞击后远隔部位的损伤比较轻，也可能是撞击之后时间较长，以致出现了神经修复和再生。

表1　各组各指标阳性细胞数的比较

1)与对照组比较，P<0.05；2)与对照组比较，P<0.01；3)与模型组比较，P<0.01；4)与模型组比较，P<0.05。

图1　对照组、模型组和小檗碱组:(A)对侧皮层Iba1和GFAP免疫荧光染色图片，标尺=100 μm；(B)各组对侧皮层COX-2和iNOS的免疫组化染色图片以及(C)8-OHdG和NEUN的免疫组化染色图片，标尺=50 μm。

此外，我们还发现盐酸小檗碱能够抑制TBI后对侧皮层小胶质细胞的增殖活化以及炎症因子COX-2、iNOS的过度表达，但是对星形胶质细胞增殖活化的抑制作用并不显著。小檗碱对TBI后对侧皮层神经炎症的抑制作用可能与腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路、核因子AP-1(activator protein-1)或NF-K B(nuclear factor kappa B)等信号通路有关[11]。我们发现盐酸小檗碱对撞击对侧皮层的DNA氧化损伤没有抑制作用，但是我们在研究小檗碱对损伤附近皮层DNA氧化损伤和NEUN阳性神经元数量影响的实验中发现小檗碱显著减少8-OHdG阳性细胞数量和增加NEUN阳性细胞，分析其原因可能与颅脑创伤对对侧皮层影响较轻，炎症反应和氧化损伤也较损伤附近皮层神经炎症反应和氧化损伤显著轻，因此本实验发现对侧皮层神经元基本没有丢失，小檗碱抗氧化损伤的作用也不明显。

综上所述，我们发现TBI后小鼠远隔对侧皮层也可以出现继发性的炎症反应、DNA氧化损伤，盐酸小檗碱对这种TBI后远隔皮层的继发性脑损害可能存在保护作用，可能为盐酸小檗碱用于治疗TBI继发性损害提供依据。

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(责任编辑：甘章平)

Effects of berberine chloride on secondary brain injury in contralateral parietal lobe cortex of TBI model mice.

HUANG Shuxuan, ZHU Feiqi, PEI Zhong, ZHU Jinhua, YANG Zhi, DENG Xuhui, LIU Yuan.

Department of Neurology, Yuebei People’s Hospital, Medical School of Shantou University, NO.133 HuiMinNan Road, Shaoguan 512026, China. Tel: 0751-6913930

Objective To examine neuroinflammation，oxidative damage and neuron loss in the contralateral parietal lobecortex of TBI model mice, and to investigate effects of berberine chloride on such secondary damage. MethodsTBI model was established by a weight-drop hitting device and mice in berberine group were administered intragastrically with berberine chloride (50mg/kg.day) for 21 days. Immunofluorescence staining was used to assess activity of microglia and astrocyte. Immunohistochemistry was used to assess DNA oxidative damage, neuron loss and expression of COX-2 and iNOS. ResultsActivation of microglia and astrocyte, expressions of COX-2 and iNOS and DNA oxidative damage were obviously increased by TBI，(19.82±1.88)and(16.96±1.69)、(13.79±4.32)and(8.67±0.96)、(27.86±5.38) and(16.00±7.59)、(31.92±6.57)and(24.79±2.78)respectively (P<0.01 orP<0.05). Activation of microglia and expressions of COX-2 and iNOS were significantly suppressed by berberine ,(15.49±1.88)and(19.82±1.88)、(16.83±7.89)and(27.86±5.38)、(26.25±2.41)and(31.92±6.57) respectively(P<0.01 orP<0.05). There was no difference in neuron loss among three groups, (49.05±4.38),(48.56±3.56)and (47.75±4.14) respectively (P>0.05). ConclusionsTBI can cause neuroinflammation and oxidative damage but not neuron loss in the contralateral parietal lobe cortex. Berberine chloride can significantly suppress neuroinflammtion in the contralateral parietal lobe cortex after TBI.

Traumatic brain injuryBerberine chlorideContralateral cortexNeuroinflammationOxidative damageNeuron loss

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.06.004

☆广东省自然科学基金面上项目(编号：S2013010015786)；韶关市科技计划项目[编号：韶科(卫)2010-01]

*汕头大学医学院附属粤北人民医院神经内科(韶关512026)

△深圳罗湖区人民医院神经内科

※中山大学附属第一医院神经科

E-mail：zfqzsu2004@aliyun.com)

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2016-01-31)